GV3101 感受态细胞 返回列表页

GV3101 感受态细胞介绍：

C58(rifR)TipMP90(pTiC58DT-DNA)(gentR)Nopaline  

GV3101 感受态细胞产品说明：  

GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：gent，赋予GV3101菌株庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，本公司生产的GV3101化学转化感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒检测转化效率>104cfu/μgDNA。  

操作方法：  

1.取-80℃保存的农杆菌感受态于室温或手心片刻待其部分融化，处于冰水混合状态时插入冰中。  

2.每100μl感受态加入0.01-1μg质粒DNA（转化效率较高，次使用前做预实验确定所加质粒的量），用手管底混匀，依次于冰上静置5分钟、液氮5分钟、37℃水浴5分钟、冰浴5分钟。  

3.加入700μl无抗生素的LB或YEB液体培养基，于28℃振荡培养2~3小时。  

4.6000rpm离心一分钟收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的LB或YEB平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。  

（当平板只含有50μg/mlkan时，28℃培养48h即可；平板中同时加入50μg/mlkan，20μg/mlrif时，需28℃培养60h；如果使用的平板含有50μg/mlrif则需要28℃培养72-90h）。  

注意事项：

1.加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。  

2.混入质粒时应轻柔操作。转化高浓度的质粒可相应减少终用于涂板的菌量。  

3.平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。  

4.利福平浓度不应高于25μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态计算转化效率时所用平板只含有50μg/mlkan，若所用平板含有20μg/mlrif则转化效率降低到1/2。  

5.培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入Ti质粒筛选抗生素可防止Ti质粒丢失，但Ti质粒筛选抗生素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑这些抗生素，Ti质粒丢失的概率极低(可以忽略)。  

备注：  

1、农杆菌相关抗生素配方：

2、常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、LB及YEB配方：

10种农杆菌化学转化感受态产品仅需冰、液氮和37℃ 热激操作即可，实验简单方便，经pCAMBIA2301 (11.6 Kb)质粒检测转化效率可达1×104 cfu/μg。同时提供7种农杆菌电击感受态产品，可成功转化大于50 Kb的载体，经pCAMBIA2301 (11.6 Kb)质粒检测转化效率可达1×105 cfu/μg。