EGY48 Chemically Competent Cell  酵母感受态细胞

基因型：

MATα, ura3, his3, trp1, LexAop (x6)-LEU2

简要说明：

EGY48菌株是LexA系统酵母双杂实验用菌株，MATα型，可直接转化质粒验证蛋白互作或筛库；Transformation marker为：his3，trp1,ura3，报告基因为：LEU2；报告基因UAS (上游激活序列)来源于LexA op(x6)，只有当Bait和Prey互作时才能启动LEU2表达。EGY48-LexA系统有三种配套质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ。质粒pLexA筛选标志为HIS3，用于表达DNA-BD与目标蛋白(Bait)的融合蛋白；质粒pB42AD筛选标志为TRP1，用于表达AD与目标蛋白(Prey)的融合蛋白；报告质粒p8op-LacZ筛选标志为URA3，报告基因为LacZ，报告基因UAS来源于LexAop(x6)，只有当Bait和Prey互作时才能启动LacZ表达。EGY48感受态细胞经特殊工艺制作，pGBKT7质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA

操作说明：

1. 取pBait-AbAi质粒5µg，BstBI或 BbsI酶切1h，回收；

2. 取一支无菌的1.5ml EP管，依次加入预冷的预冷的线性pBait-AbAi质粒1-5 µg（体积不高于15 µl），Carrier DNA(95-100 度5min 快速冰浴，重复一次)10µl，100µl冰上融化的Y1HGold感受态细胞，PEG/LiAc 500µl，轻轻翻转混匀6-8次；

3. 30℃水浴30min，每10min轻轻翻转混匀6-8次；

4. 每支加入20µl的二甲基亚砜（用以提高转化效率，可不做）；

5. 42℃水浴15min，每5min轻轻翻转混匀6-8次；

6. 12000rpm瞬时离心弃上清，每支加入1ml的YPD Plus（YPDA）于30℃复苏1h（用以提高转化效率，可不做）；

7. 12000rpm瞬时离心弃上清，用100µl 0.9% NaCl重悬，涂板，30℃培养48-96h。

注意事项：

1.PEG在低温下易析出，请在常温下wan全溶解后使用。

2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

4.Y1HGold酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

5.菌落变粉不是污染，是酵母细胞生长中一个常见现象。当细胞在平板培养几天后，平板上的Adenine被酵母消耗完毕，酵母试图通过自身代谢途径合成Adenine以供利用，然而，Y1HGold的ADE2基因被破坏，Adenine合成途径受阻；又由于其ADE4,5,6,7,8基因均正常，所以造成中间产物P-ribosylaminoimidazole（AIR）在细胞中积累而使菌落变为粉红色。

6.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48h培养可见直径1mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60h培养可见直径1mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80h培养可见直径1mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1mm克隆。