K599 Electroporation-Competent Cell 发根(电击)感受态细胞

基因型：

Agrobacterium rhizogenes (strR ) pRi2659 (agropine type)

简要说明：

发根农杆菌是根瘤菌科(Rhizobiaceae)农杆菌属(agrobacterium)的一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物以及个别裸子植物。K599发根农杆菌（NCPPB2659）含有pRi2659农杆碱型Ri质粒，具有广泛的宿主范围（葫芦科，豆科，茄科等），同时具有lian霉素抗性。 K599电转感受态细胞经特殊工艺制作，pCAMBIA2301质粒（ka那霉素抗性）检测，转化效率>103 cfu/μg DNA

操作说明：

一： 0.1 cm电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上5分钟，待其沥干水分，正置5分钟，使乙醇充分挥发，待乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面0.5 cm以方便盖上杯盖，冰中静置5分钟充分降温。

二： 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中5分钟，待其融化，加入0.01-1 μg质粒DNA（体积不大于6ul，最好用试剂盒抽提，双蒸水溶解；转化效率较高，第一次使用前最好做预实验确定所加质粒的量），用手bo打管底混匀，立即插入冰中，用200μl枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上杯盖，空管保留待用。

三：启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐的protocol操作），将电击杯从冰中拿出，吸水纸吸干外表面水份，快速放入电转槽中，启动电击，电击完成快速插入冰中，加入1 ml无抗生素的TY，并转移到感受态空管中，28℃振荡培养2~3小时。

四： 6000 rpm离心一分钟收菌，留取100 μl左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的TY平板上，倒置放于28℃培养箱培养2-3天。

注意事项：

一：加入质粒时体积不应大于感受态体积的1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一倍，转化效率下降一个数量级。

二： 电转感受态细胞中不可混入气泡，转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

三：平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量或最终用于涂板的菌量。

四：K599具有lain霉素抗性，不可用于具有lian霉素抗性质粒的转化。

备注：

1、农杆菌相关抗生素配方：

2、常用农杆菌抗性：（R：抗；S：敏感。）

3、TY配方（1L）：

Tryptone 5gYeast extract 3g补水到1L体积，wan全溶解后，121度、20分钟高温灭菌配制1M的氯化钙水溶液，121度、20分钟高温灭菌每1L 灭菌的TY液体营养液中加入10ml 无菌的1M氯化钙水溶液即可。若配制TY固体培养基，则加入15g 琼脂粉。