描述：

AO/PI双染试剂盒是采用 AO/PI 探针双染细胞核的方法检测凋亡细胞的状态，是细胞凋亡形态学研究常用的染色方法。吖啶橙（Acridine Orange，AO）为一种具有细胞膜通透性的荧光染料，该染料能透过活细胞膜，使核 DNA 和 RNA 染色。它与细胞中 DNA 和 RNA 结合量存在差别，复合物可发出不同颜色的荧光，AO 与 dsDNA 结合时发出绿色荧光，而与 ssDNA 和 RNA 结合时发出红色荧光。当与 DNA 结合时，它与荧光素在光谱上非常相似，激发最大值为 502nm，发射最大值为 525nm（绿色）。当它与 RNA 结合时，激发最大值移至 460nm（蓝色），发射最大值移至 650nm（红色）。

在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光；而在凋亡细胞中，因染色质固缩或断裂为大小不等的片断，形成凋亡小体。吖啶橙使其染上致密浓染的黄绿色荧光，或黄绿色碎片颗粒；而坏死细胞黄荧光减弱甚至消失。Propidium Iodide 是一种 DNA 结合性染料，其激发和发射波长分别为 488nm 和 630nm，产生红色荧光，但无膜通透性，不能透过活细胞膜，只能染死细胞。因此，在荧光显微镜下观察，正常细胞不能着色，早期凋亡细胞呈微弱红光，晚期凋亡细胞红光加强，坏死细胞呈强红色荧光。

应用：

流式细胞仪；激光共聚焦；荧光显微镜

使用方法：

1、试剂准备：
PBS 缓冲液（pH7.4）或者HBSS（Hank's Balanced Salt Solution）

2、耗材准备
离心管、吸头、一次性手套

3、染色工作液配制：
（1） 根据样品数，按下列比例配制染色缓冲液。 取 100μL 试剂 C 用 900μL 纯水稀释，充分混匀即成染色缓冲液。
（2）每 500μL 染色缓冲液加入 5ul AO 染色液和 10ul PI 染色液，充分混匀，即成染色工作液。

4、悬浮细胞染色
（1）收集样本细胞，细胞数量在 10X105 个以内。
（2）用 PBS 洗涤细胞两次。
（3）用 500μL 染色工作液将细胞重悬。
（4）轻轻混匀后 4℃避光孵育 10-20 分钟。
（5）用 PBS 洗涤细胞。
（6）用荧光显微镜或流式细胞仪检测结果。

5、贴壁细胞原位染色
（1）用 PBS 洗涤细胞 2 次。
（2）细胞培养板中或细胞爬片上加入适量体积的染色工作液。
（3）37 ℃孵育细胞 10～20 分钟，不同的细胞最佳培养时间不同。可以用 20 分钟作为起始孵育时间，之后优 化体系以得到均一的标记结果。
（4）吸干染色工作液，用培养基洗培养板或盖玻片 2～3 次，每次用预热的培养基覆盖所有细胞，然后吸干培养基。

结果分析 ：
在荧光显微镜下，选用 488nm 激发光镜检：
AO 染色正常细胞 DNA 呈均匀黄色或黄绿色，形态结构正常。
当细胞凋亡时，染色质浓缩，细胞核碎裂成点状，被染成大小不一、致密浓染。
坏死细胞呈强红色荧光。

注意事项：

1、螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
2、细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。
3、本染色试剂盒可用于细胞、细胞涂片等。以下以悬浮培养细胞的荧光显微镜检测为例，其他方法请参阅相关资料。
4、贴壁细胞可以消化下来染色，也可以直接原位染色。