1. 快速内切酶SpeI DNA 快速酶切流程:
① 在冰上按如下建议的加样顺序配制反应体系:
| 质粒 DNA | PCR 产物 | 基因组 DNA |
ddH2O | 15 μl | 16 μl | 30 μl |
10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 3 μl(a) | 5 μl |
底物 DNA | 2 μl (up to 1 μg) | 10 μl (~0.2 μg) | 10 μl (5 μg) |
Spel | 1 μl | 1 μl | 5 μl |
Total | 20 μl | 30 μl | 50 μl |
a. 本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度,10× Cut Buffer 加入量可适当减少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性,会影响酶切产物,因此如下一步需进行克隆等操作,建议酶切前对 PCR 产物进行纯化。
② 轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋),然后瞬时离心以收集挂壁液滴;
③ 37℃温育 15 min(质粒),或 15~30 min(PCR 产物),或 30~60 min(基因组 DNA);
④ 80℃温育 20 min 即可使酶失活,停止反应(可选)。
2. 双酶切或多酶切:
① 每种快速内切酶的用量为 1 μl,并根据需要适当扩大反应体系;
② 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10;
③ 如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同,应先以最适温度低的酶开始酶切,再添加最适温度较高的酶,在其最适反应温度下进行酶切反应。
3. 适用于质粒的扩大反应体系:
DNA | 1 μg | 2 μg | 3μg | 4 μg | 5 μg |
Spel | 1 μl | 2μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl |
10× Cut Buffer 或 10× Cut Color Buffer | 2 μl | 2 μl | 3 μl | 4 μl | 5 μl |
Total | 20 μl | 20 μl | 30 μl | 40 μl | 50 μl |
注:如果总反应体系大于 20 μl,应适当增加温育时间,尽量使用水浴、金属浴或沙浴。
不同 DNA 中的酶切位点数量:
λDNA | ΦX174 | pBR322 | pUC57 | pUC18/19 | SV40 | M13mp18/19 | Adeno2 |
0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3 |
甲基化修饰影响:
Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
无影响 | 无影响 | 无影响 | 序列可能重叠 剪切可能受影响 | 序列可能重叠 剪切可能受影响 |
在不同反应缓冲液中的活性:
| Cut Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB CutSmart® Buffer | Takara QuickCut™ Buffer |
活性 | 100% | 100% | 100% | 100% |