2 × 预混实时荧光定量快速PCR反应体系用户需自备的试剂:cDNA 或 DNA 模板、引物、ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II。
请按照不同品牌荧光定量PCR仪的使用说明书要求进行实验操作。
操作示例:分别以20 µ l和50 µ l PCR反应体系为例:
1. PCR 反应体系的建立:
组分 | 20ul体系 | 50ul体系 |
DNA模板 | 1ul | 1ul |
正向引物(10uM) | 0.5ul | 1ul |
反向引物(10uM) | 0.5ul | 1ul |
2×RealStar Green Fast Mixture | 10ul | 25ul |
ROX Reference Dye/ROX Reference Dye II | 0.4ul | 1ul |
RNase-free H2O | 补足至20ul | 补足至50ul |
*模板量: 10-100 ng基因组DNA,或 1-10 ng cDNA 为参照,因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同,可对模板进行梯度稀释,以确定最佳的模板使用量。 另外, Two Step RT-PCR 反应的cDNA( RT 反应液)作为模板时的添加量不要超过 PCR 反应液总体积的10% 。
*引物:通常引物浓度以 0.2 μM 可以得到较好结果,可以终浓度 0.1-1.0 μM 作为设定范围的参考。扩增效率不高的情况下,可提高引物的浓度;发生非特异性反应时,可降低引物浓度,由此优化反应体系。为了获得理想的 qPCR 的效果,扩增片段的长度建议为 80-200 bp 。
*不同仪器所需 ROX Reference Dye不同,或需要添加或不需要添加,请根据仪器说明进行操作。
2。PCR 反应条件的设置: 本制品中使用的HotStart Taq DNA Polymerase是利用抗Taq抗体封闭的HotStart DNA聚合酶,如果在PCR反应 前进行模板的预变性,通常设定为95℃、2 min,复杂或高GC模板适当延长时间至5 min。该DNA聚合酶在15 s内可完成至 少300 bp的扩增,可以满足绝大多数的qPCR实验;对于超过350 bp或者高GC含量的扩增子,建议增加延伸时间至60 s或者 采用三步法以提高扩增效率。
两步法 PCR 扩增标准程序: |
预变性 | 95℃ | 2min |
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变性 | 95℃ | 15s | 40 Cycles
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退火/延伸 | 60℃ | 15-30s |
溶解曲线(仪器自动设置) |
三步法 PCR 扩增程序: |
预变性 | 95℃ | 2min |
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变性 | 95℃ | 15s | 40 Cycles
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退火 | 60℃ | 15-30s |
延伸 | 72℃ | 30s |
溶解曲线(仪器自动设置) |
注 : 以上举例为常规 qPCR
反应系统,仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异 , 需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件,并根据比例放大或缩小反应体系。
3. 在相应的 real time PCR 仪器上完成实验,并分析结果。