组分 | 质粒 DNA | PCR 产物 | 基因组 DNA |
ddH2O | 15ul | 16ul | 30ul |
10× CutOne Buffer 或 10× CutOne Color Buffer | 2ul | 3ula | 5ul |
底物 DNA | 2ul (up to 1ug) | 10ul (~0.2ug) | 10ul (5ug) |
SfiI | 1ul | 1ul | 5ul |
Total | 20ul | 30ul | 50ul |
a. 本体系适用于经过纯化的 PCR 产物酶切。未纯化的 PCR 产物具备一定的离子强度,10× Cutone Buffer 加入量可适当减少至 2 μl。但由于 DNA 聚合酶同时具有外切酶活性,会影响酶切产物,因此如下一步需进行(2)轻柔吸打或轻弹管壁以混匀(切勿涡旋),然后瞬时离心以收集挂壁液滴;
(3)50℃温育 15 min(质粒),或 15~30 min(PCR 产物),或 30~60 min(基因组 DNA);
(4)酚氯仿抽提或柱纯化(可选);
(5) 如果使用 CutOne Color Buffer 进行酶切反应,得到的产物可以直接进行上样电泳。
2、双酶切或多酶切(1)每种快速内切酶的用量为 1 μl,并根据需要适当扩大反应体系;
(2) 所有快速内切酶的体积总和不得超过总反应体系的 1/10;
(3)如果所用的几种快速内切酶的最适反应温度不同,应先以最适温度低的酶开始酶切,再添加最适温度较高的酶,在其最适反应温度下进行酶切反应。
3、适用于质粒的扩大反应体系
DNA | 1ug | 2ug | 3ug | 4ug | 5ug |
SfiI | 1ul | 2ul | 3ul | 4ul | 5ul |
10× CutOne Buffer 或 10× CutOne Color Buffer | 2ul | 2ul | 3ul | 4ul | 5ul |
Total | 20ul | 20ul | 30ul | 40ul | 50ul |
不同 DNA 中的酶切位点数量
λDNA | ΦX174 | pBR322 | pUC57 | pUC18/19 | SV40 | M13mp18/19 | Adeno2 |
0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 0 | 3 |
甲基化修饰影响
Dam | Dcm | CpG | EcoKI | EcoBI |
无影响 | 剪切受影响 | 剪切受影响 | 无影响 | 无影响 |
在不同反应缓冲液中的活性
| CutOne Buffer | Thermo Scientific FastDigest Buffer | NEB CutSmart® Buffer | Takara QuickCut™ Buffer |
活性 | 100% | 100% | 100% | 100% |