紫外可见近红外分光光度计应用方法

紫外可见近红外分光光度计应用方法

定量测定的应用方法

多波长紫外分光光度法

多波长分光光度法解决了单波长分光光度法中浊度背景干扰和共存物质的光谱干扰问

题。多波长分光光度法适用于混浊样品，高浓度样品以及多组分混合物的定量分析。

一、双波长紫外分光光度法

双波长分光光度法的特点是以样品浓度本身做参比，用两束单色光 λ₁ 和 λ₂ 交替入射到

同一样品溶液中，测得的是差吸光度⊿A＝⊿λ₁－⊿λ₂，⊿A 与样品溶液浓度或含量成正比，

而：

⊿A＝Aλ₂－Aλ₁＝（ελ₂－ελ₁）CL （2－14）

因此该法可用于定量分析，双波长紫外分光光度法适用于样品溶液单组分测定和多组分测

定。多组分测定主要采用等吸收点法和系数倍率法。

单组分测定一般选择待测组分的 λ_ma_x 为测定波长 λ₂，等吸收点波长或待组分吸收曲线

下端的某一波长作为参比波长 λ₁，然后测定差吸光度值（⊿A＝Aλ₂－Aλ₁），求样品溶液中

待测组分的含量或浓度。

如果样品溶液中有共存干扰吸收物质，则通常采用等吸收点法和系数倍率法等。下面

简单介绍这两种方法。

1、等吸收点法

等吸收点波长的确定可采用作图法、一波长固定另一波长扫描法、精密确定法和快速

简便法等。这些内容已有许多专著供参考。用等吸收波长法消除干扰吸收时，必须满足，在

干扰组分的吸收光谱中有等吸收点，使差吸光度值⊿A 足够大。混合样品溶液两组分的等吸

收点波长 λ₂ 和 λ₁ 有这样特点：差吸光度⊿A＝Aλ₂－Aλ₁，只与其中一组分浓度有关，而与

另一组分浓度无关，这是该法的定量基础；另外应该指出等吸收点波长既可做参比波长，也

可做测定波长。等吸收点法主要用于二组分体系的测定。下面举一些应用实例，以加深等吸

收点法的理解。

（1）有机化合物的测定实例

① 均四甲苯和聚苯乙烯的测定，均四甲苯和聚苯乙烯混合物等吸收点波长利用作图法

求得 λ₁＝280.7nm，λ₂＝261.8nm（见图 1）。在这两波长处，对均四甲苯来说（不论浓

度大小），其⊿A＝Aλ₂－Aλ₁＝0，换言之，⊿A只与聚苯乙烯浓度有关，所以在这两

个选定波长处测定混合样品的吸光度差值⊿A 就可直接求得聚苯乙烯的含量。

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图 1：均四甲苯和聚苯乙烯混合样品的 UV 吸收光谱

图中 聚苯乙烯（4×10^-3 mol/l）

 均四甲苯（1×10^-3 mol/l）

② 2，4，6 三氯苯酚存在下苯本分含量的测定 2，4，6 三氯苯酚和苯酚混合样品等吸

收点波长 λ₁＝268 nm（或 325 nm），λ₂＝270 nm（图 2 为作图法选择等吸收点波长；图

3 为扫描法，即苯酚的 λ_ma_x＝270 nm 为固定波长，对浓度不同的 2，4，6 三氯苯酚溶

液进行扫描求得）。同样道理，选择这两个波长并测定在 λ₂ 和 λ₁ 处的吸光度差值⊿A。

⊿A 只与苯酚浓度有关，而与 2，4，6 三氯苯酚浓度无关，所以由⊿A 值便可测定苯

酚的含量。在邻硝基苯酚存在下，对硝基苯酚的测定也可用双波长分光光度法测定。

图 2：2,4,6-三氯苯酚和苯酚的 UV 吸收光谱

a.苯酚；b.2,4,6-三氯苯酚（浓度为 30ppm）

〔 λ₁=286（或 325）nm，λ₂=270nm 〕

图 3：固定苯酚 λ₂=270nm，对不同浓度

不同浓度的 2,4,6-三氯苯酚溶液扫描的差吸

收 UV 光谱

③间－苯二甲酸存在下对－苯二甲酸的测定 利用作图法选择间－苯二甲酸

（10mg/10ml）和对－苯二酸甲（0.5mg/100ml）的等吸收点波长为 λ₂＝262.5nm 和 λ₁

＝277.0nm（见图 4），在此波长组合下，间－苯二甲酸的⊿Aλ₂－λ₁＝0，对－苯二甲酸

的标准曲线线性良好，测定结果令人满意。

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图 4：间-苯二甲酸和对-苯二甲酸的 UV 吸收光谱

1—间-苯二甲酸；2—邻-苯二甲酸

④ 苯偏三酸酐中苯偏三酸的测定 用作图法和精密确定法选择等吸收波长为

307.6nm，而苯偏三酸的 λ_ma_x＝290nm（见图 5）。由图可知，用双波长光度法测得⊿A

＝Aλ₂－Aλ₁，只与苯偏三酸浓度有关，⊿A 与苯偏三酸酐浓度无关。故可利用双波长

紫外光度法测定苯偏三酸含量。

图 5：苯偏三酸酐和苯偏三酸的 UV 吸收光谱

1—苯偏三酸酐；2—苯偏三酸

（2）在无机分析中的实例

当样品溶液中有两组分的性质相近时，例如钴与锝、铁与铝、铂与钯等，这些组分所

形成的络合物的吸收光谱相互重叠，且能够找到各自的等吸收点，均可采用双波长分光光度

法对共存组分分别测定。如用 8－羟基喹啉同时测定铁、铝就是一例。

 图 6 为铝和铁的络合物吸收光谱，显然测定波长 λ₁＝385.0nm。图 7 为一波长固定

（385.0nm）、一波长扫描所得的曲线，等吸收点波长（λ₂^′＝437.0nm，和 λ₂＝499.5nm）可

做参比波长，显然⊿A＝Aλ₁－Aλ₂^′或 ⊿A＝Aλ₁－Aλ₂ 都消除了干扰组分的影响。

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图 6：铝（A）铁（B）的络和物吸收光谱

（λ₁＝385 nm，λ₂’＝263nm，

λ₂＝498 nm）

图 7：一波长固定（385nm）一波长扫描所得

的曲线

Fe₂O₃ 浓 度 (µg/10ml)A—20.0 ； B—60.0 ；

C—100.0

（3）药物和维生素测定实例

① 复方头孢氨芐胶囊中头孢氨芐的测定 用作图法求得头孢氨芐和甲氧芐氨嘧啶

（TMP）混合物等吸收点波长 λ₁＝305.5 nm，λ₂＝263nm（头孢氨芐的 λ_ma_x），以 λ₂ 为

测定波长，λ₁ 为参比波长，测量混合物样品的⊿A，⊿A 只与头孢氨芐浓度有关（见图

8）。因此，可由一系列头孢氨芐的乙醇标准溶液，分别在 λ₂＝263nm 和 λ₁＝305.5nm

处测定吸光度，并求出⊿A，以⊿A 为纵坐标，以头孢氨芐浓度为横坐标，绘制标准曲

线。然后按同样方法测定样品中⊿A，在标准曲线上查出对应头孢氨芐的浓度或含量^[7^]。

② 双嘧啶片中甲氧芐氨嘧啶（TMP）的测定 用作图法求得 TMP 和磺胺嘧啶（SD）

的等吸收点波长，λ₂＝274.8nm（为测定波长），λ₁＝308nm（为参比波长），在这两波

长处测得只与 TMP 浓度有关，与 SD 浓度无关。然后可用标准曲线法，求得样品中 TMP

 的含量（图 9）^[8^]。

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图 8：头孢氨芐和 TMP 的 UV 吸收光谱

1－头孢氨芐；2－TMP；

3－头孢氨芐+TMP

图 9：TMP 和 SD 的 UV 吸收光谱

a－TMP(30µg/ml)；b－SD(24µg/ml)；

c－辅料

③ 维生素 A 和 E 的测定 维生素 A 的测定波长选在 305nm，维生素 E 对应等吸收波

长为 270.8nm（见图 10）。用双波长紫外分光光度法测定⊿A＝Aλ₃0₅－Aλ₂07.₈，则⊿A 只与

维生素 A 含量有关（与维生素 E 含量无关），故可测定维生素 A 含量。

图 10：维生素 A、E 的 UV 吸收光谱

1－维生素 A；2－维生素 E

而维生素 E 的 λ_ma_x＝292nm 做测定波长，用精密确定法找出维生素 A 对应等吸收点波

长为 349.9nm，显然，⊿A＝Aλ₂9₂－Aλ₃49.₉ 只与维生素 E 含量有关，可用双波长紫外分光光

度法测定。

双波长紫外分光光度法的出现，使药物分析出现了迅猛发展，许多药剂中的混合组分都可用

此法测定，例如，复方丁氯喘片中的盐酸溴已胺（λ_ma_x＝314nm）、盐酸异丙嗪（λ_ma_x＝300nm）

可用双波长紫外光度法测定。又如，阿斯匹林中水杨酸的含量可用⊿A＝Aλ₂60.8

－Aλ₂8₂ 的差吸收值定量，防腐剂中可在⊿A＝Aλ₂54.₄－Aλ₂99.₅ 和⊿A＝Aλ₂6₉－Aλ₂35.₅ 的差吸

光度分别测定山梨酸钾和对－羟基安息香酸含量。

紫外可见近红外分光光度计应用方法