热卖细胞，MA104 细胞，人神经母细胞瘤细胞 返回列表页

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，质粒的相关知识： 一.如何阅读质粒图谱 *步：首先看 Ori 的位置，了解质粒的类型（原核/真核/穿梭质粒）。 第二步：再看筛选标记，如抗性，决定使用什么筛选标记。 --Ampr   水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性； --tetr   可以阻止四环素进入细胞； --camr   生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性； --neor(kanr)氨基糖苷磷酸转移酶 使G418（长那霉素衍生物）失活； --hygr   使潮霉素β失活。 第三步：看多克隆位点（MCS）。它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，从而便于筛选。MCS决定了能不能放置目的基因以及如何放置目的基因。 第四步：再看外源DNA插入片段大小。质粒一般只能容纳小于10Kb的外源DNA段。一般来说，外源DNA段越长，越难插入，越不稳定，转化效率越低。 第五步：是否含有表达系统元件，即启动子－核糖体结合位点－克隆位点－转录终止信号，这是用来区别克隆载体与表达载体。在克隆载体中加入一些与表达调控有关的元件即成为表达载体。选用哪种载体，要以实验目的为依据。

二.如何选择载体 把目的基因通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。基因工程所用的vector实际上是用来携带目的基因片段进入受体细胞的 DNA。 选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

,载体选择主要考虑下述3点： 1. 构建DNA重组体的目的：克隆载体/表达载体。 2. 载体的类型： 克隆载体的克隆能力：根据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。 表达载体：根据受体细胞类型：原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 原核表达载体要选择合适的启动子及相应的受体菌；表达真核蛋白时需注意阅读框错位问题；表达天然蛋白和融合蛋白所需载体亦有区别。 3. 选用质粒做载体的4点要求： （1）选分子量小的质粒，即小载体（1-1.5kb）：不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）； （2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。 （3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地； （4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因。 无论选用哪种载体，首先都要获得载体分子，然后采用适当的限制酶将载体DNA进行切割，获得载体片段，以便于与目的基因片段进行连接。

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