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上海宝叶生物科技有限公司
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scFv和载体DNA的连接
2013-3-7 阅读(1381)
[器材和试剂]
●T4DNA连接酶及10×缓冲液（NEB）
●酚/氯仿（Sigma）
●100%和70%乙醇，-20℃保存
●消化的载体和scFv文库
●TE（10mmol/L Tris pH 8，lmmol/L EDTA）
[方法]
1.如下所述，配制两个100ul连接混合液，其中1个用于VH-VκscFv文库，另1个用于Vu-VλscFv文库，并设置两个对照反应。对照可以确定未切的载体有多少（对照2），以及确定无插入序列时有多少重新连接的载体（对照1）。要保持恰当的比例，所获得的克隆数（对于相同的连接体积）应当小于基因文库的10%。
对照1 对照2
●10×连接缓冲液 10ul 0．5ul 0．5ul
●Millipore水 32ul 2．3ul 2．5ul
●已消化的pHENl 100ng/ul 40ul 2．Oul 2．0ul
●ScFv基因文库（100ng/ul） 14ul
●T4 DNA连接酶（400U/ul） 4ul 0．2ul
2．孵育混合液，16℃过夜。
3．加入TE使反应混合液体积增加至200ul。用等体积酚/氯抽提DNA。用乙醇沉淀DNA并用70%乙醇洗涤沉淀2次。
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