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上海宝叶生物科技有限公司
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在微量滴定板中表达可溶性scFv
2013-3-5 阅读(1397)
[器材和试剂]
● 用于细菌培养的96孔圆底微量滴定板 （Nunc， 目录号62162）
● 含100ug/ml氨苄青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培养基（2 ×TY/amp/
0．1％glu）
● 含100ug/ml氨苄青霉素和3mmol/L IPTG的2XTY培养基（2×TY/amp/glu/IPTG）（参见实验方案13．10）
● 噬菌体样品
[方法]
1．用96孔无菌转移设备或移液器从主板中，每孔取2ul；而后转移至1个每孔含有100ul 2×TY/amp/0.1％glu的无菌96孔微量滴定板中。
2．将孔板在37℃振荡孵育，直到A600值约为0．9（通常需2～3小时）。
3．每孔加50ul 2XTY/amp/glu/IPTG（zui终IPTG浓度为lmmol/L）。继续将孔板在30℃振荡16小时。
4．以2700r/min离心孔板15分钟；取上清可进行ELISA.
纯化scFv片段zui简单的方式是：在其C末端添加六组氨酸标签，再用固相金属离子亲和层析（1MAC）进行蛋白纯化。大多数用于IMAC的试剂现在已加工为试剂盒销售，并附有详尽的说明。不过，应当注意的是，试剂盒中所提供的实验方案也许要根据不同的scFv载体构建类型加以调整。例如，我们发现：对在His标签前带有myc标签的scFv洗涤时，该咪唑浓度（20mmol／L）比携带了其他标签的scFv的咪唑洗涤浓度（5mmol／L）更高一些。
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