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上海宝叶生物科技有限公司
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展示DNA结合性蛋白质的噬菌体文库的构想
2012-11-14 阅读(1249)
1 噬菌体展示技术合适吗?
借助在噬菌体展示技术中使用的丝状噬菌体，我们关心的DNA结合区域通常与较小的pⅢ衣壳蛋白融合后进行表达，通过细菌的细胞膜进行转移，然后被组装到包裹病毒基因组的噬菌粒颗粒的头部。zui初的多肽结构域的噬菌体展示实验，是用诸如抗体、激素或胞外酶之类的分泌性蛋白质来进行的，它们本来就可以穿过生物膜并能在氧化性环境中保持稳定；但我们现在知道，很多诸如DNA结合区域之类的胞内结构域，也可以成功地展示在噬菌体表面。即使是这样，蛋白质在细菌中的跨膜转移偶尔仍然会阻碍某些多肽（特别是那些带有较高电荷的多肽）的噬菌体展示。核酸结合区域常常带正电荷，从而与净带负电荷的磷酸二酯键形成的骨架相互作用。而我们先前注意到：有些高度碱性的结构域，如BIVTat的zui小的结构域，就不能被展示到噬菌体表面。
另外，在着手于噬菌体展示之前至少还应该考虑两个其他因素。首先，虽然能被展示的结构域的大小似乎一般没有限制（见第1章），但这个技术可能于研究较小的基序（10 kDa上下），自然界中有很多这样的基序。其次，还有一个更严格的限制，那就是绝大多数的天然基序都进化成以非共价结合的二聚体的形式，与回文结构的或近似对称的DNA字列相结合。虽然用噬菌体展示技术来筛选这样的基序也是可能的，但其他技术，如细菌的“单杂交”（one-hybrid）方法，可能更适合于这个任务。
2 了解蛋白质的DNA结合模式了吗?
从锌指结构的噬菌体展示中得到的zui重要的经验之一，就是预先了解蛋白质与DNA相互作用的模式可能是非常重要的。一个高分辨率的蛋白质—DNA结构显示了与DNA结合的模式以引起分子间识别的接触方式，这无疑为这个问题提供了zui大的帮助。一个明显的需要考虑的因素就是所关心的基序是以单体的形式还是以二聚体的形式与DNA结合的。锌指结构尤其适合于噬菌体展示，因为它们是以共价连接的串联体（concatamer）的形式与DNA结合的，允许对不对称DNA序列的识别。
另一个需要考虑的因素，是复合体（complex）中的DNA是否以任何方式变形。一个严重变形的复合体不意味着噬菌体展示的实验是不可能的，而可能是预示筛选只可能针对一个有限的DNA序列的子集进行的，或者是预示得到的DNA结合区域可能是非特异性结合的。从极少量的DNA序列能形成结合所需的结构这个意义上来说，诱导后的蛋白质与DNA恰当的相互作用是高度专门化的。因此在这些情况中，分子间的识别常常高度依赖于与不直接包含序列信息的DNA骨架的接触。从Zif268和与其相关的蛋白质的晶体结构中可以看到，锌指结构在几何结构上适合于结合DNA，不会对双螺旋结构造成任何较大的混乱。
3 应该随机突变蛋白质的哪一个结构域?
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