谷*酸（Glu）含量检测试剂盒说明书（WST法）

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC5215

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂三：临用前取1瓶加入6mL试剂一，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂四：临用前取1支加入0.5 mL试剂二，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

3、 标准液：10 μmol/mL谷*酸标准品。

产品说明：

Glu广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，不仅是组成蛋白质的20种氨基酸之一，而且通过转氨基作用参与多种氨基酸合成，是生物体内主要氨基来源之一。此外，Glu还是味精的主要有效成分，常用做食品添加剂以及香料生产。

谷*酸脱氢酶（GDH）催化谷*酸和NAD生成α-酮戊二酸、NADH和NH₄⁺，在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH 反应，产生水溶性formazan，计算谷*含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/超声破碎仪、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌、细胞：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1mL试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次），10000g，常温离心10min，取上清待测。

组织：称取约0.1g组织，加入1mL试剂一，进行冰浴匀浆，10000g，常温离心10min，取上清待测。

液体：直接测定。（若有浑浊则离心后取上清测定）

二、测定步骤

1. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至450nm，分光光度计蒸馏水调零。

2. 标准溶液的制备：将标准品用蒸馏水分别稀释为0.625，0.3125，0.15625，0.07813，0.039、0.0195、0.01、0.005、0.0025μmol/mL的标准溶液。

3. 标准品稀释表：

实验中每个标准管需40µL标准溶液。

4. 操作表：

三、谷*酸含量计算

1. 标准曲线的绘制：

根据标准管的浓度（x，µmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA代入方程得到x（µmol/mL）。

2. 谷*酸含量计算：

（1）按照蛋白浓度计算：

谷*酸含量（µmol/mg prot）=x×V样本÷（Cpr×V样本）=x÷Cpr

（2）按照样本质量计算：

谷*酸含量（µmol/g 质量）=x×V样本÷（W÷V样总×V样本）=x÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算：

谷*酸含量（μmol/10⁴ cell）=x×V样本÷（500÷V样总×V样本）=0.002x

（4）按照液体体积计算：

谷*含量（μmol/mL）=x×V样本÷V样本=x

V样总：加入提取液体积，1mL；V样本：加入的样本体积，0.04mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。

注意事项：

1、如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

实验实例：

1、称取约 0.1g 鼠肺，加入 1mL试剂一，冰浴研磨，10000g，常温离心10min取上清，待测。之后按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算 ΔA =A2 -A1=0.449-0.384=0.065，标准曲线y=1.5338x+0.0091，根据标曲得出x=0.036，谷*酸含量得：
*氨酸含量（µmol/g 质量）=x×V样本÷（W÷V样总×V样本）=x÷W=0.36µmol/g。

2、吸取0.04 mL羊血清，按照测定步骤操作，用 96 孔板测得计算ΔA =A2-A1=0.379-0.105=0.274，标准曲线y=1.5338x+0.0091，根据标曲得出x=0.173，谷*酸含量得：
谷*酸含量（μmol/mL）=x×V样本÷V样本=x=0.173μmol/mL。

相关发表文献：

[1] Yanan Wang,Chengzhen Liang,Zhigang Meng,et al. Leveraging Atriplex hortensis choline monooxygenase to improve chilling tolerance in cotton. Environmental and Experimental Botany. June 2019;162:364-373.(IF3.712)

参考文献：

[1] Beck R, Malthe-Sørenssen D, Andreassen J P. Polycrystalline growth in precipitation of an aromatic amine derivative and l-glutamic acid[J]. Journal of crystal growth, 2009, 311(2): 320-326.

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