线粒体呼吸链复合体Ⅴ/ATP合酶活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1445
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前每支加入1.11 mL双蒸水，充分溶解备用，分装后-20℃保存4周，避免反复冻融；

2. 试剂五：临用前加入10mL双蒸水，充分溶解；-20℃可保存4周；

3. 试剂六：临用前加入10mL双蒸水，充分溶解；2-8℃可保存4周；

4. 标准品：10 μmol/mL磷标液，临用前取50μL 10 μmol/mL磷标液，加入1950μL蒸馏水，充分混匀，配制成0.25μmol/mL标准液使用，现用现配（实验中每管需要40μL，为减小实验误差，故配制大体积）；

5. 定磷试剂的配制：根据用量将H₂O：试剂五：试剂六：试剂七=20mL:10mL:10mL:10mL（约100T）混合备用，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

注意：配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器，或者一次性塑料器皿，以避免磷污染。
产品说明：
线粒体复合体Ⅴ又称F₁F₀-ATP合酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，由F₁和F₀两个亚单位组成。该酶利用呼吸链产生的质子电化学梯度催化ATP合成，也可逆过程水解ATP。此外，复合体Ⅴ还存在于叶绿体、异养菌和光合细菌中。复合体Ⅴ是线粒体氧化磷酸化和叶绿体光合磷酸化合成ATP的关键酶。
复合体Ⅴ水解ATP产生ADP和Pi，通过测定Pi增加速率来测定复合体Ⅴ活性。
   
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性，需先取1-2个样做预实验，如果测定的吸光值过高（高于1），可用蒸馏水稀释上清液后再测定。计算结果时注意乘以稀释倍数。

2. 测定胞浆时，定磷后反应液可能会有絮凝产生，测定前混合均匀即可，并不影响测定结果。

3. 推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。

4. 本试剂盒试剂足够完成100管反应。

5. 附:使用样本重量计算公式：（样本检测数为100T/24S）

1. 上清中复合体Ⅴ活力的计算：

单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1nmol无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA1÷ΔA标准×C标准×V酶促×1000÷(W÷V提取×V样本)）÷T
=20×ΔA1÷ΔA标准÷W
ΔA1：上清测定值；C标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V提取：加入提取液体积，1.0mL；V样本：样本体积，0.05mL；V酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。
B、沉淀中复合体Ⅴ活力的计算：
单位的定义：每g组织在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=ΔA2÷ΔA标准×C标准×V酶促×1000÷(W÷V提取×V样本)）÷T
=12×ΔA2÷ΔA标准÷W
ΔA2：沉淀测定值；C标准：标准溶液浓度，0.25μmol/mL；1000：单位换算系数，1μmol=1000nmol；V提取：沉淀重悬体积，0.6mL；V样本：样本体积，0.05mL；V酶促：酶促反应总体积，0.12mL；T：反应时间，30min。
C、样本复合体Ⅴ总活力的计算：
样本复合体Ⅴ总活力即为上清中复合体Ⅴ活力与沉淀中复合体Ⅴ活力之和。
按样本质量计算：复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W+12×ΔA2÷ΔA标准÷W
实验实例：

1. 取0.1g兔子肾脏进行样本处理，上清液和沉淀都稀释4倍后按照测定步骤操作，使用96孔板测得ΔA标准=A标准管-A空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的ΔA1=A测定管-A对照管=0.679-0.119=0.560，沉淀的ΔA2=A测定管-A对照管=0.773-0.052=0.721，则按样本质量计算得：上清中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×4（稀释倍数）=1349.4 U/g 质量沉淀中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=12×ΔA2÷ΔA标准÷W×4（稀释倍数）=1042.4 U/g 质量复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×4+12×ΔA2÷ΔA标准÷W×4=2391.8 U/g 质量。

2. 取0.1g冬青进行样本处理，上清液和沉淀都稀释2倍后按照测定步骤操作，使用96孔板测得ΔA标准=A标准管-A空白管=0.379-0.047=0.332，上清液的ΔA1= A测定管-A对照管=0.535-0.320=0.215，沉淀的ΔA2=A测定管-A对照管=0.357-0.089=0.268，则按样本质量计算得：上清中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×2（稀释倍数）=259.04 U/g 质量 沉淀中复合体Ⅴ活性（U/g 质量）=12×ΔA2÷ΔA标准÷W×2（稀释倍数）=193.73 U/g 质量复合体Ⅴ（U/g 质量）=20×ΔA1÷ΔA标准÷W×2+12×ΔA2÷ΔA标准÷W×2=452.77 U/g 质量。

相关发表文献：

1. Qiuli OuYang,Nengguo Tao,Miaoling Zhang. A Damaged Oxidative Phosphorylation Mechanism Is Involved in the Antifungal Activity of Citral against Penicillium digitatum. Frontier in Immunology. February 2018;(IF4.259)  

2. Wang M, Zhang Y, Xu M, et al. Roles of TRPA1 and TRPV1 in cigarette smoke-induced airway epithelial cell injury model[J].Free Radical Biology and Medicine,2019,134:229-238.

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