磷脂酶D（PLD）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2415

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1．提取液二：试剂易挥发，用完后快速拧盖，封口膜缠口；

2．试剂三：试剂放于试剂瓶内玻璃管中临用前取一支加入1.26 mL乙醇充分溶解后取上清使用；2-8℃可以分装保存2周，避免反复冻融；

3．标准品：50umol/mL 胆*溶液，临用前用试剂一稀释100倍即500nmol/mL标准溶液备用（可以取10μL50umol/mL 胆*溶液加入990μL试剂一混匀即500nmol/mL标准溶液 ）。

产品说明：

磷脂酶D（Phospholipases D，PLD）催化水解磷脂酰胆*末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆*，胆*在胆*氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安*比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、超速冷冻离心机、可调式移液枪、天平、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、蒸馏水、无水乙醇和冰。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例加入提取液，建议称取约0.1g样本，加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二，冰浴匀浆后于4℃，10 000g离心5min；取全部上清于4℃、100 000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

2、 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入0.99mL提取液一和0.01mL提取液二），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；然后于4℃，10 000g离心5min；取全部上清于4℃、100 000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL试剂一。

3、 血清（浆）：直接测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长到500nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 样本测定：

三、酶活计算

1、 按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆*产生1nmol胆*所需的酶量一个酶活力单位。

PLD活性 (U/mg prot) =ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V提取÷(Cpr×V提取)÷T = 16.7×ΔA测定÷ΔA标准÷Cpr

2、 按样本质量计算

酶活定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆*产生1nmol胆*所需的酶量一个酶活力单位

PLD活性 (U/g 鲜重) = ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V提取÷W÷T = 16.7×ΔA测定÷ΔA标准÷W

3、 按细菌或细胞数量计算

酶活定义：每10⁴个细胞每分钟水解磷脂酰胆*产生1nmol胆*所需的酶量一个酶活力单位。

PLD活性(U/10⁴ cell）= ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V提取÷细胞数量÷T = 16.7×ΔA测定÷ΔA标准÷细胞数量

4、 按血清（浆）计算：

酶活定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆*产生1nmol胆*所需的酶量一个酶活力单位。

PLD活性（U/mL）= ΔA测定÷ΔA标准×C标准×V血清（浆）÷V血清（浆）÷T = 16.7×ΔA测定÷ΔA标准

C标准：标准液浓度，500nmol/mL；V提取：加入的提取液体积（提取液一+提取液二），1mL；V血清（浆）：血清（浆）体积，0.02mL；W：样本质量，g；细胞数量：以万计；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，30min。

注意事项：

1. 显色完成后，若有沉淀，于8000g，25℃离心5min后取上清测定。

2. 吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。

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