苯胺-4-羟化酶（AH）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2745

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取一瓶加入60mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂2-8℃可保存4周；

2、 试剂三：临用前取一瓶加入6mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

3、 试剂四：临用前加入3mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂2-8℃可保存4周；

4、 试剂六：临用前取一瓶加入6mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂2-8℃密封可保存4周。

5、 标准品：10nmol/mL 标准溶液

产品说明：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。

AH催化苯胺羟化后产生的4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在630nm处有特征吸收峰；通过测定630nm吸光度增加速率，来计算AH活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、超速离心机、水浴锅/恒温培养箱、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 粗酶液提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g，4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加0.5mL试剂二，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计预热30min以上，调节波长至630nm，蒸馏水调零。

2、 试剂五置于冰浴冷却30min。

3、 在EP管加入下列试剂：

三、AH活性计算

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃条件下，每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。

AH活性(U/mg prot) = C标× V上总×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷（Cpr×V样）÷T

= 2×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1nmol 4-氨基酚为1个酶活单位。

AH活性(U /g 质量) = C标×V上总×（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷(V样×W÷V试剂二)÷T

=（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W

C标：10nmol/mL；V上总：反应体系中上清总体积，0.3mL；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V样：反应体系中加入的样本体积，0.05mL；W：样本质量，g；V试剂二：提取中加入的试剂二体积，0.5mL；T：催化反应时间，30min。

注意事项：

1、如果测定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数。

2、如果测定吸光值较低或接近空白OD值，建议增加样本量后再进行测定，注意同步修改计算公式。

3、粗酶液提取后需在当日完成测定。

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