NADPH-细*色素C还原酶（NCR）活性检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC2725

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂一：临用前取一瓶加入100mL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂4℃保存可保存4周；

2、 试剂三：临用前取一支加入520μL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融。

3、 试剂四：临用前取一支加入550μL蒸馏水，充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融。

产品说明：

细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员，催化氧化型P450还原再生。

NCR催化NADPH还原氧化型细*色素C，还原型细*色素C在550nm处有特征吸收峰；通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、超速离心机、恒温培养箱/水浴锅、研钵/匀浆器、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1、除去细胞核和线粒体等：称约0.5g组织，加入4℃预冷的1mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g，4℃离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加0.5mL试剂二，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，置于冰上待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至550nm，分光光度计用蒸馏水调零。

2、 临用前根据实验用量取出部分试剂二在37℃水浴中预热30min。

3、空白管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入10μL蒸馏水、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，测定第10s和第130s吸光值，分别记为A1、A2。计算ΔA空白=A2-A1。空白管只需做1-2次。

4、测定管：取微量玻璃比色皿/96孔板，依次加入10μL粗酶液、180μL试剂二、10μL试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，测定第10s和第130s吸光值，分别记为A3、A4。ΔA测定=A4-A3。

三、NCR活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃条件下，每毫克蛋白每分钟催化产生1μmol还原型细*色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min /mg prot)= (ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷（Cpr×V样）÷T

= 550×(ΔA测定-ΔA空白)÷Cpr

（2）按样本质量计算

活性单位定义：37℃条件下，每克组织每分钟催化产生1μmol还原型细*色素C为1个酶活单位。

NCR ((nmol/min/g 质量)= (ΔA测定-ΔA空白)÷(ε×d)×V反总÷(V样÷V样总×W)÷T

=275×(ΔA测定-ΔA空白)÷W

ε：还原型细*色素C摩尔消光系数，19100L/mol/cm=0.0191L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V反总：反应体系总体积，210μL=2.1×10^-4L；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V样：加入反应体系中粗酶液体积，10μL=0.01mL；V样总：样本处理中最后加入试剂二体积，0.5mL；W：样本质量，g；T：反应时间，2min。

b.使用96孔板测定的计算公式如下

将上述计算公式中比色皿光径d=1cm改为d=0.6cm进行计算即可。

注意事项：

1、如果测定吸光值A＞1.5或ΔA＞1，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数。

2、如果测定吸光值较低或接近空白OD值，建议增加样本量后再进行测定，注意同步修改计算公式。

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