目录:北京索莱宝科技有限公司>>生化检测试剂盒-微量法>>微量法生化试剂盒>> BC1545-100T/48S亚硝酸还原酶(NiR)检测试剂盒 微量法
| CAS | 详询 | 纯度 | 详询 |
|---|---|---|---|
| 分子量 | 详询 | 分子式 | 详询 |
| 供货周期 | 现货 | 规格 | 50T/24S |
| 货号 | BC1540 | 应用领域 | 环保,化工,生物产业,农业,综合 |
| 主要用途 | 亚硝酸还原酶(NiR)活性检测 |
亚硝酸还原酶（NiR）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC1545
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂一 | 液体3mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×2瓶 | 2-8℃保存 |
试剂三 | 粉剂×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂四 | 液体10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂五 | 液体10mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
标准品 | 液体1mL×1支 | 2-8℃保存 |
溶液的配制：
1、 试剂二：每瓶临用前加入2.5mL蒸馏水充分溶解，2-8℃保存2周；
2、 试剂三：临用前加入5mL蒸馏水，可70-80℃加热溶解；2-8℃可以保存3个月；
3、 试剂五：若出现沉淀，可70-80℃加热溶解；
4、 标准品：10µmol/mL亚硝*标准溶液；
5、 工作液：临用前根据样本量将试剂四和试剂五按1:1的比例混合，现用现配。
产品说明：
亚硝酸还原酶（Nitrite reductase，NiR）是亚硝态氮还原过程中的关键酶，在自然界氮素循环过程中发挥着重要作用，其广泛存在于微生物及植物体内，能够催化亚硝酸盐还原，减少亚硝态氮在环境中的积累，降低其对生物体生长发育的毒害作用。
亚硝酸还原酶可将NO2-还原为NO，使样本中参与重氮化反应生成紫红色化合物的NO2-减少，即540nm处吸光值的变化可反应样本中亚硝酸还原酶的活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、天平、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1. 组织：按样本质量（g）: 提取液体积（mL）1 : 5~10比例（建议称取0.1g样本，加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后，于4 ℃，10000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。
2. 细菌或细胞：按细胞数量（104）：提取液体积（mL）500~1000 : 1的比例（建议500万细胞加入1.0mL提取液）加入提取液，冰浴超声破碎细胞（功率200w，超声3s，间隔7s，总时间3min），然后于4℃，10000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤
1、 分光光度计/酶标仪预热30min 以上，调节波长至540nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、 标准液的稀释：将10µmol/mL的标准溶液用蒸馏水稀释至0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125 µmol/mL标准溶液待测。
3、 标准液稀释可参考下表：
序号 | 稀释前浓度（µmol/mL） | 标准液体积（µL） | 蒸馏水体积（µL） | 稀释后浓度（µmol/mL） |
1 | 10 | 20 | 180 | 1 |
2 | 1 | 100 | 400 | 0.2 |
3 | 0.2 | 200 | 200 | 0.1 |
4 | 0.1 | 200 | 200 | 0.05 |
5 | 0.05 | 200 | 200 | 0.025 |
6 | 0.025 | 200 | 200 | 0.0125 |
7 | 0.0125 | 200 | 200 | 0.00625 |
8 | 0.00625 | 200 | 200 | 0.003125 |
备注：下述实验中每个标准管需70µL标准液（注意不要在此步骤直接检测吸光值）。
4、 样本测定：
试剂名称（μL） | 基质管 | 对照管 | 测定管 | 标准管 | 空白管 |
样本 | - | 20 | 20 | - | - |
蒸馏水 | 20 | 40 | - | - | - |
试剂一 | 40 | - | 40 | - | - |
试剂二 | 40 | 40 | 40 | - | - |
混匀后，25℃反应1h | - | - | |||
试剂三 | 40 | 40 | 40 | - | - |
充分震荡30s，常温静置5min，取上清 | - | - | |||
上清液 | 70 | 70 | 70 | - | - |
标准品 | - | - | - | 70 | - |
蒸馏水 | - | - | - | - | 70 |
工作液 | 140 | 140 | 140 | 140 | 140 |
充分混匀，常温静置5min，于微量玻璃比色皿或96孔板中测定540nm各管吸光值，分别记为A基质管、A对照管、A测定管、A标准管和A空白管，计算ΔA测定=A基质管-（A测定管-A对照管），ΔA标准=A标准管-空白管。空白管、标准管和基质管只需测1-2次，每个测定管需设一个对照管。 | |||||
三、亚硝酸还原酶活性计算
1. 标准曲线的绘制
以标准溶液浓度为x轴（x，μmol/mL），标准溶液对应的ΔA标准为y轴（y，ΔA标准），建立标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程得到x（μmol/mL）。
2. 酶活计算
（1）按照蛋白浓度计算
酶活单位定义：每mg组织蛋白每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（U/mg prot）=x×V1÷V2×V提÷（Cpr×V提）÷T=x×7÷Cpr
（2）按照样本质量计算
酶活单位定义：每g组织每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（U/g 质量）=x×V1÷V2×V提÷W÷T=x×7÷W
（3）按照细菌/细胞数量计算
酶活单位定义：每104个细菌/细胞每小时还原1μmol NO2ˉ的量为一个酶活力单位。
NiR（U/104 cell）=x×V1÷V2×V提÷细菌/细胞数量÷T=x×7÷细菌/细胞数量
V1：取上清液前的反应体系体积，0.14mL；V2：加入的样本体积，0.02mL；V提：加入的提取液体积，1.0mL；T：反应时间，1h；W：土样质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细菌/细胞数量：以104计。
实验实例：
1、 取0.1g杨树叶片加入1mL提取液进行匀浆研磨，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA测定= A基质管-（A测定管-A对照管）=0.863-（0.705-0.065）=0.223，带入标准曲线y=8.4313x+0.003，R2=0.9999，计算x=0.0261，按样本质量计算酶活得：
NiR（U/g 质量）=x×7÷W=0.0261×7÷0.1=1.827 U/g 质量。
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