微生物及液体样本中甲醛脱氢酶（FDH）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC4995

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前去1支加入0.25 mL蒸馏水，震荡使其充分溶解（1瓶粉剂溶解后可做100T，为了延长使用时间，此产品多给1瓶粉剂），可分装后-20℃保存2周，避免反复冻融。

2、 试剂二工工作液：临用前按试剂二：蒸馏水=1:29的体积比例稀释试剂二，现用现配。

3、 试剂三：临用前取1支加入0.6 mL蒸馏水，震荡使其充分溶解。用不完的试剂2-8℃分装保存2周。

产品说明：

甲醛脱氢酶存在于绝大多数原核生物以及所有的真核生物中，是一种将甲醛进行转换的氧化还原酶。甲醛脱氢酶催化甲醛和 NAD⁺产生 NADH，在 340nm 处的吸光值会增加，测定 340nm处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔UV板、低温离心机、恒温水浴锅/培养箱、可调式移液枪、超声波细胞破碎仪、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每500万细菌或细胞加入1 mL提取液，超声波破碎细胞（功率300w，超声3s，间隔9s，总时间 3 min）；然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清（若上清不够澄清，建议重复上述离心步骤），置于冰上待测。

血清及液体样本：直接检测。

二、测定步骤

1、 紫外分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至340 nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 临用前将试剂一置于37℃预热10 min。

3、 在微量石英比色皿或96孔UV板中依次加入 20 μL 样本、110 μL试剂一、50 μL试剂二工作液、10 μL试剂三、10 μL试剂四，充分混匀后于340nm处测定20s时的吸光值A1，迅速置于37℃水浴或培养箱5min（酶标仪有控温功能可将温度调至37℃），拿出迅速擦干测定5min20s时的吸光值A2。计算ΔA=A2-A1。

三、酶活性计算

A、按微量石英比色皿计算

1、细菌或培养细胞中FDH活力的计算

（1）按细菌或细胞数量计算：

单位的定义：每10⁴个细菌或细胞每分钟催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/10⁴ cell）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样÷V样总×N）÷T×F =321.54×ΔA÷N×F

（2）按蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

2、血清（浆）或液体样本FDH活力的计算

（1）按液体体积计算：

单位的定义：每mL液体样本中每分钟催化1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷V样÷T×F =321.54×ΔA×F

（2）按蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化生成1 nmol NAD⁺生成1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。

FDH酶活（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反总×10⁹÷（V样×Cpr）÷T×F=321.54×ΔA÷Cpr×F

e：NADH 摩尔消光系数，6220 L/ mol/cm；d：石英比色皿光径，1cm；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；V反总：酶促反应总体积，2×10^-4L；V样总：加入提取液体积，1 mL；V样：加入样本体积，0.02 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；N：细胞或细菌总数，以万计；F：稀释倍数；10⁹：单位换算系数，1mol=10⁹ nmol。

B、按96孔UV板计算

将上述公式中d=1cm变为d=0.6cm，代入公式进行计算即可。

注意事项：

1、如果测定吸光值A＞1.5或ΔA＞0.5，建议稀释样本后再测定，计算公式中乘以稀释倍数；如果测定吸光值较低，建议增加样本量后再进行测定。

2、试剂四有毒性，实验时请佩戴口罩手套等防护措施。

实验实例：

1、 取0.1g大肠杆菌沉淀加入1 mL提取液，超声波破碎细胞（功率300W，超声3s，间隔9s，总时间 3min）；然后8000 g，4℃，离心10 min，取上清按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA=A2-A1=0.2523-0.0396=0.2127，按细菌数量计算酶活得：

FDH酶活（U/10⁴ cell）= 321.54×ΔA÷N =683.9 U/g。

2、 取0.02 mL牛血清按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA =A2 -A1 =0.1101-0.0772=0.0329，按液体体积计算酶活得：

FDH酶活（U/mL）=321.54×ΔA=10.579 U/mL。

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