肌酸含量检测试剂盒说明书

微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC4925

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前加入0.33mL乙醇溶解，-20℃可以保存2周，试剂若变为深棕色则不可再使用；

2. 试剂一工作液：临用前根据样本量按试剂一：试剂一稀释液=40μL：560μL（共600μL，约15T）的比例进行配制，现配现用，当天用完；

3. 标准品：1 mg一水肌酸。临用前加入1 mL蒸馏水，充分溶解，即1 mg/mL一水肌酸标准储备液。用不完的试剂4℃保存一个月。

产品说明：

肌酸(Creatine)是一种含氮化合物，自然存在于脊椎动物体内，能够辅助为肌肉和神经细胞提供能量。肌酸可由精*酸（arginine)、甘*酸（glycine）及甲硫*酸（methionine）三种氨基酸合成，可由人体自行合成，也可以从食物中摄取。大约95%的肌酸存在于骨骼肌中，主要存在形式为磷酸肌酸。肌酸作为一种补充剂主要通过增加肌肉质量，增强运动表现能力。肌酸也被作为神经肌肉疾病的一种治疗药被广泛研究，它可能有助于保护神经和改善细胞生物功能状态。

肌酸可在碱性条件下与联乙酰-α-萘酚发生反应，生成红色产物在530 nm处有吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁶个）：提取液一体积（mL）为5~10：1的比例（建议5×10⁶个细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

3. 血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，12000g离心10min后取上清待测。

注：提取液二需缓慢加入，加入后会产生大量气泡，建议使用2mL EP管进行操作。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至530 nm，蒸馏水调零。

2、 标准溶液配制：将1 mg/mL一水肌酸标准储备液，用蒸馏水稀释至200、160、130、100、50、25、12.5 μg/mL标准溶液待用。

3、 按下表步骤加样：

注：空白管只需做1-2次。

三、肌酸含量计算

1、 标准曲线绘制：以肌酸标准溶液浓度为横坐标（x，μg/mL），以ΔA标准为纵坐标（y）绘制标准曲线，得到线性回归方程y=kx+b，将ΔA测定带入方程求得x（μg/mL）。

2、 计算公式

（1）按照蛋白浓度计算

肌酸含量（μg/mg prot）=x×V样÷（V样×Cpr）×0.879=x÷Cpr×0.879

（2）按照样本质量计算

肌酸含量（μg/g 质量）=x×（V上清+V提取液二）÷ （W×V上清÷V提取液一）×0.879=1.044×x÷W

（3）按照细菌或细胞数量计算

肌酸含量（μg/10⁴ cell）= x×（V上清+V提取液二）÷（细胞数量×V上清÷V提取液一）×0.879

= 1.044×x÷细胞数量

（4）按照血清（浆）体积计算

肌酸含量（μg/mL）=x×（V上清+V提取液二）÷ [V液体×V上清÷（V提取液一+V液体）]×0.879=11.482×x

V样：加入样本体积，20 μL=0.02 mL；V上清：提取液一提取时上清液体积，0.8 mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；细胞或细菌数量，以10⁴计；V提取液一：加入提取液一体积，1 mL；V提取液二：

加入提取液二体积，0.15 mL；V液体：液体样本体积，0.1 mL；0.879：换算系数，一水肌酸相对分子质量149.15，无水肌酸相对分子质量131.13，0.879=131.13÷149.15。

注意事项：

1、显色完成后，请在10 min之内完成检测。

2、提取液中含有蛋白沉淀剂，提取的上清液不能用于蛋白浓度的测定。若想要用蛋白浓度计算肌酸含量需要另取样本，即取相同质量的组织、同等数目的细菌或细胞，用1.1875mLPBS（生理盐水）匀浆；取相同体积的血清（浆），用1.206mLPBS（生理盐水）匀浆（相当于提取步骤最终样本上清液），用BCA法进行蛋白浓度测定。

3、如果测定吸光值低于或超过标准溶液线性范围的吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

4、试剂一、试剂二对人体有刺激性，请采取适当的防护措施。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴乳胶手套操作。

实验实例：

取0.1g兔肾脏加入1mL提取液一进行匀浆研磨离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后按照测定步骤操作，用96孔板测定后计算ΔA测定=A测定-A对照=0.128-0.064=0.064，带入标准曲线y=0.0062x-0.0143，计算x=12.629。按样本质量计算含量得：

肌酸含量（μg/g 质量）=1.044×x÷W =131.85 μg/g 质量。

取100μL牛血清加入1mL提取液一，离心取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，用96孔板测定后计算ΔA测定=A测定-A对照=0.271-0.07=0.201，带入标准曲线y=0.0062x-0.0143，计算x=34.726。按照液体体积计算含量得：

肌酸含量（μg/mL）=11.482×x= 398.7 μg/mL。

肌酸含量检测试剂盒