5'-核苷酸酶（5'-NT）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC4595

规格：100T/48S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制： 

1、 试剂五：临用前加入4 mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂2-8℃保存两周。

2、 试剂六：临用前加入4 mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂2-8℃保存两周。

3、 工作液配制：临用前取1支试剂一中加入到1瓶试剂二中充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存一周，现用现配。

4、 定磷试剂的配制：按H₂O：试剂五：试剂六：试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。

5、 标准品：8 mg 磷标准品。临用前加入4.6 mL试剂四溶解配制成10 μmol/mL的标准溶液，溶解后2-8℃保存。

产品说明：

5'-核苷酸酶(5'-NT)是一种对底物特异性不高的水解酶，可作用于多种核苷酸。广泛存在于各种植物、动物组织、血清血浆中。5'-NT是一种特殊的磷酸酯水解酶，它作用于核苷-5'-磷酸如AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成无机磷酸和核苷。通过定磷显色法测定所生成的无机磷含量，可以计算出5'-NT的活性高低。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

天平、可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、低温离心机、恒温水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）﹕提取液体积(mL)为 1﹕5-10 的比例（建议称取约0.05 g，加入0.5 mL提取液），冰上匀浆后于4℃，15000 g 离心10 min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）﹕蒸馏水体积（mL）为500-1000﹕1 的比例（建议500万个细胞加入0.5 mL 蒸馏水），冰浴超声波破碎细胞（功率300 W，超声3 s，间隔7 s，总时间3 min）；然后4℃，15000 g 离心10 min，取上清置于冰上待测。

3. 血清：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30 min以上，调节波长至660 nm，蒸馏水调零。

2、 将标准品用试剂四稀释至0.96、0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 μmol/mL标准液。

3、 标准品稀释表

实验中每个标准管需80µL标准溶液。

4、 操作表（在1.5 mL EP管中操作）

（1） 酶促反应

（2） 显色反应

三、5'-NT活性计算

1、 标准曲线的绘制：

以各个标准溶液的浓度为x轴，其对应的ΔA标准为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y= kx+b，将ΔA带入方程得到x（μmol/mL）。

2、 5'-NT活性的计算

（1）按样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每mg组织蛋白在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

5'-NT酶活（U/mg prot）=x×V反总÷(V样×Cpr)÷T×10³=333.3×x÷Cpr

（2）按样本质量计算

酶活单位定义：每克组织在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活单位。

5'-NT酶活（U/g 质量）=x×V反总÷(W×V样÷V样总)÷T×10³=166.67×x÷W

（3）按细胞数计算：

酶活单位定义：每10⁴个细胞在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

5'-NT酶活（U/10⁴ cell）=x×V反总÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T×10³=166.67×x÷细胞数量

（4）按液体体积计算：

酶活单位定义：每毫升液体在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。

5'-NT酶活（U/mL）=x×V反总÷V样÷T×10³=333.3×x

V样：酶促反应中加入样本体积，0.02 mL；V反总：酶促反应总体积，0.2 mL；V样总：加入提取液的体积，0.5 mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；细胞数量：以万计；T：酶促反应时间，30 min；10³：单位换算，1 μmol=10³ nmol。

注意事项：

1. ΔA测定大于1或者A测定管大于1时，建议将样本用试剂四稀释后再进行测定。

实验实例：

1、取0.05g小鼠肝，进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.449-0.334=0.115，带入标准曲线y=1.5514x+0.0038，计算x=0.0717，按照样本质量计算酶活得：

5'-NT酶活（U/g 质量）=333.3×x÷W=333.3×0.0717÷0.1=238.98 U/g 质量。

2、取0.05g稗草，进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定管=A测定-A对照=0.245-0.196=0.049，带入标准曲线y=1.5514x+0.0038，计算x=0.0291，按照样本质量计算酶活得：

5'-NT酶活（U/g 质量）=333.3×x÷W=333.3×0.0291÷0.1=97.00 U/g 质量。

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