多胺氧化酶（PAO）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5225

规格：100T/96S

产品内容：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制： 

1、 工作液：临用前根据实验所需量按照试剂一：试剂二：试剂三=600μL：60μL：60μL（约5T）的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：

多胺氧化酶（Polyamine Oxidases，PAO）是催化生物体内多胺氧化的关键酶，多胺能够与核酸、蛋白质、细胞膜分子互作，直接影响细胞的生长、分化和凋亡，而PAO可通过调节细胞内多胺水平和生成物的浓度，参与各种植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。

PAO催化多胺氧化生成H₂O₂，过氧化物酶在有氧存在时催化H₂O₂分解，同时将邻联茴香胺氧化生成有色物质，在500nm处有特征吸收峰，颜色深浅与PAO活性成线性关系。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、天平、水浴锅/恒温培养箱、台式低温离心机、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰、蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照组织质量（g）︰提取液体积（mL）为1︰5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）进行冰浴匀浆。于4℃，10000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

2. 细胞或细菌：按照细胞或细菌数量（10⁴个）︰提取液体积（mL）为500~1000︰1的比例（建议500万细胞或细菌加入1mL提取液），冰浴超声波破碎细胞或细菌（功率200W，超声3s，间隔7s，总时间3min），于4℃，10000g离心10min，取上清，置于冰上待测。

3. 液体：直接测定。若有沉淀，离心后测定。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至500nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 测定前将工作液置于37℃水浴锅/恒温培养箱预热10min以上。

3、操作表：在96孔板或EP管中分别加入下列试剂：

三、计算公式

A. 按96孔板计算：

1. 按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每毫克蛋白每分钟催化在500nm处吸光值增加0.0005定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/mg prot）＝ΔA×V反÷（V样×Cpr）÷T÷0.0005×F=133.33×ΔA÷Cpr×F

2. 按照样本质量计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每克组织每分钟催化在500nm处吸光值增加0.0005定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/g 质量）＝ΔA×V反÷（W÷V提×V样）÷T÷0.0005×F=133.33×ΔA÷W×F

3. 按照细胞数量计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每10⁴ 个细胞或细菌每分钟催化在500nm处吸光值增加0.0005定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/10⁴ cell）＝ΔA×V反÷（500÷V提×V样）÷T÷0.0005×F=0.2666×ΔA×F

4. 按液体体积计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每毫升液体样本每分钟催化在500nm处吸光值增加0.0005定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/mL）＝ΔA×V反÷V样÷T÷0.0005×F=133.33×ΔA×F

V反：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本上清体积，0.05mL；V提：加入提取液的体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞或细菌数量，500万；T：反应时间，60min；F：稀释倍数。

B. 按比色皿计算：

1. 按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每毫克蛋白每分钟催化在500nm处吸光值增加0.001定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/mg prot）=ΔA×V反÷（V样×Cpr）÷T÷0.001×F=66.67×ΔA÷Cpr×F

2. 按照样本质量计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每克组织每分钟催化在500nm处吸光值增加0.001定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/g 质量）=ΔA×V反÷（W÷V提×V样）÷T÷0.001×F=66.67×ΔA÷W×F

3. 按照细胞数量计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每10⁴ 个细胞或细菌每分钟催化在500nm处吸光值增加0.001定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/10⁴ cell）=ΔA×V反÷（500÷V提×V样）÷T÷0.001×F=0.133×ΔA×F

4. 按液体体积计算

酶活单位定义：在每毫升反应体系中，每毫升液体样本每分钟催化在500nm处吸光值增加0.001定义为一个酶活力单位。

PAO活性（U/mL）=ΔA×V反÷V样÷T÷0.001×F=66.67×ΔA×F

V反：反应总体积，0.2mL；V样：加入样本上清体积，0.05mL；V提：加入提取液的体积，1mL；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；500：细胞或细菌数量，500万；T：反应时间，60min；F：稀释倍数。

实验实例：

1、 称取0.1023g珍珠梅叶片加入1mL提取液进行样本处理，离心取上清后按测定步骤操作，用96孔板测得A1=0.197，A2=0.382，ΔA=A2-A1=0.185，根据计算公式得：

PAO活性（U/g 质量）=133.33×ΔA÷W=133.33×0.185÷0.1023=241.115 U/g 质量

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