D-乳酸脱氢酶（D-LDH）活性检测试剂盒说明书

可见分光光度法

货号：BC5280

规格：50T/24S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入1.6 mL蒸馏水，充分溶解。用不完的试剂分装保存，-20℃可保存4周，避免反复冻融；

2、 标准品：20 μmol/mL 丙酮酸钠溶液。

产品说明：

乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是糖酵解途径的末端酶，催化丙酮酸与乳酸之间的可逆反应，伴随着NAD⁺/NADH之间互变。根据其催化底物-乳酸构型的不同，可分为D-乳酸脱氢酶（D-LDH，EC 1.1.1.28）与L-乳酸脱氢酶（L-LDH，EC 1.1.1.27）。

D-LDH催化NAD⁺氧化D-乳酸生成丙酮酸，丙酮酸进一步与2,4-二硝*苯肼作用生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中显棕红色，颜色深浅与丙酮酸浓度成正比。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）等其他液体：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。

二、测定步骤

1、 可见分光光度计预热30min以上，调节波长至450nm，蒸馏水调零。

2、 标准溶液的稀释：将20μmol/mL丙酮酸钠标准溶液用蒸馏水进行稀释得到2、1.5、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125μmol/mL标准溶液备用。

3、 标准溶液稀释可参考下表：

备注：实验中每个标准管需50µL标准溶液。

4、 在1.5mL EP管按下表步骤加样

充分混匀，室温静置3min，取1mL转移至1mL玻璃比色皿中，450nm下测定吸光度，计算ΔA测定=A测定-A对照，ΔA标准=A标准-A空白。空白管和标准曲线只需做1-2次，每个测定管需要设一个对照管。

三、D-LDH活性计算

1. 标准曲线的绘制

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA标准（y，ΔA标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA测定（y，ΔA测定）带入公式计算样本浓度（x，μmol/mL）。

2. D-LDH活性计算

(1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

D-LDH活性（U/mg prot）= x×V样÷（Cpr×V样）÷T×10³×F=66.67×x÷Cpr×F

(2) 按样本质量计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

D-LDH活性（U/g 质量）= x×V样÷（W÷V样总×V样）÷T×10³×F=66.67×x÷W×F

(3) 按细菌/细胞数量计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

D-LDH活性（U/10⁴ cell）= x×V样÷（N÷V样总×V样）÷T×10³×F=66.67×x×F÷N

(4) 按血清（浆）等液体体积计算

单位的定义：每mL血清（浆）等液体每分钟催化产生1nmol丙酮酸定义为一个酶活力单位。

D-LDH活性（U/mL）=x×V样÷V样÷T×10³×F=66.67×x×F

V样：反应体系中加入的样本体积，0.05mL；V样总：加入的提取液体积，1mL；T：反应时间，15min；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；N：细胞或细菌数量，以万计；10³：单位换算系数，1μmol/mL=10³nmol/mL；F：样本稀释倍数。

注意事项：

1. 如果测定管吸光值接近空白或ΔA测定过低，可适当加大样本量后重新测定；如果测定管吸光值超过1.5或ΔA测定超过0.4，建议将样本用提取液适当稀释后进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1、 取0.109g兔肾加入1mL提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.437-0.326=0.111，带入标准曲线y=0.6126x+0.0162，计算x=0.155，按样本质量计算酶活得：

D-LDH活性（U/g 质量）=66.67×x÷W×F =94.653 U/g 质量

2、 取0.1018g拟南芥加入1mL提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.256-0.207=0.049，带入标准曲线y=0.6126x+0.0162，计算x=0.054，按样本质量计算酶活得：

D-LDH活性（U/g 质量）=66.67×x÷W×F =35.065 U/g 质量

3、 取500万细胞样本加入1mL提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.249-0.195=0.054，带入标准曲线y=0.6126x+0.0162，计算x=0.062，按细菌/细胞数目计算酶活得：

D-LDH活性（U/10⁴ cell）=0.133×x×F =0.008U/10⁴ cell

4、 取50μL胎牛血清，按照测定步骤操作，用1mL玻璃比色皿测得计算ΔA测定=A测定-A对照=0.360-0.217= 0.143，带入标准曲线y=0.6126x+0.0162，计算x=0.207，按液体体积计算酶活得：

D-LDH活性（U/mL）=66.67×x×F =13.800 U/mL

参考文献：

[1] Huang P H, Fu L C, Huang C S, et al. The uptake of oligogalacturonide and its effect on growth inhibition, lactate dehydrogenase activity and galactin-3 release of human cancer cells[J]. Food chemistry, 2012, 132(4): 1987-1995.

[2] Huang Y N, Xu G T, You C P. The research progress of the lactate dehydrogenases in lactic acid bacteria[J]. Science and Technology of Food Industry, 2016, (08): 369-373.

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