丙酮酸（PA）含量检测试剂盒（酶法）说明书

                                               微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。

货号：BC5265

规格：100T/48S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 试剂二：临用前加入1.2mL蒸馏水充分溶解，分装保存，-20℃可以保存4周，避免反复冻融；

2、 试剂三：临用前按试剂三：蒸馏水=1μL：100μL（约6T）的比例进行稀释，现用现配。

3、 标准品：20 μmol/mL丙酮酸钠标准液。

产品说明：

丙酮酸通过乙酰 CoA 连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。

在pH = 7.5 时，丙酮酸在LDH的催化作用下与NADH反应，生成NAD ⁺ 和乳酸。在1-mPMS作用下，WST-1可与NADH反应，产生水溶性formazan。通过检测450nm条件下吸光值，可以计算出丙酮酸含量。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液枪、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁶个）：提取液体积（mL）为5~10：1的比例（建议5百万细菌或细胞加入1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200w，超声3s，间隔10s，重复30次）；8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

2. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3. 血清（浆）等其他液体：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。

二、测定步骤

1、 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到450nm，分光光度计蒸馏水调零。

2、 试剂一37℃预热20min。

3、 标准品的制备：将20μmol/mL丙酮酸钠标准液用蒸馏水稀释得到1、0.625、0.5、0.3125、0.25、0.15625μmol/mL标准溶液备用。

4、 标准品稀释表：

实验中每个标准管需20µL标准溶液。

5、 操作表：（在1.5mL EP管中依次加入下列试剂）

三、丙酮酸含量计算

1、标准曲线绘制：

根据标准管的浓度（x，μmol/mL）和吸光度ΔA_标准（y，ΔA_标准），建立标准曲线。根据标准曲线，将ΔA_测定代入方程得到x（μmol/mL）。

2、丙酮酸含量计算：

（1）按液体样本的体积计算

丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V样÷V样= x

（2）按组织质量计算

丙酮酸含量（μmol/g 质量）= x×V样÷(V样÷V提×W) = x÷W

（3）按蛋白浓度计算

丙酮酸含量（μmol/mg prot）= x×V样÷（Cpr×V样）= x÷Cpr

（4）按细菌/细胞数量计算

丙酮酸含量（μmol/10⁶ cell）= x ×V样÷（V样÷V提×N）= x÷N

V样：加入的样本体积，0.02mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V提：加入提取液的体积，1mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞数量，以百万计。

注意事项：

1. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者用蒸馏水稀释样本后再进行测定。

实验实例：

1、 称取约0.1g鼠肺，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g，4℃离心10min，取上清待测。之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA_测定=（A_空白1- A_空白2）-（A_测定-A_对照）=（1.156-0.045）-（0.595-0.271）=0.787，标曲y=0.8502x+0.0217，x=0.900µmol/mL, 计算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 质量）= x×V样 ÷(V样÷V提×W) = x÷W =9.00µmol/g 质量。

2、 称取约0.1g鸢尾，加入1mL提取液，冰浴研磨，8000g， 4℃离心10min，取上清待测。之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA_测定=（A_空白1- A_空白2）-（A_测定-A_对照）=（1.156-0.045）-（0.545-0.207）=0.773，标曲y=0.8502x+0.0217，x=0.884µmol/mL, 计算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（µmol/g 质量） = x×V样 ÷(V样÷V提×W) = x÷W =8.837µmol/g 质量。

3、 收集约500万细胞，加入1mL提取液，超声波破碎（功率 200w，超声3s，间隔10s，重复30次），8000g，4℃离心10min，取上清待测。之后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA_测定= （A_空白1- A_空白2）-（A_测定-A_对照）=（1.156-0.045）-（0.770-0.098）=0.439，标曲y=0.8502x+0.0217，x=0.491µmol/mL, 计算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（μmol/10⁶ cell）= x ×V样÷（V样÷V提×5）=0.2 x= 0.098 μmol/10⁶ cell。

4、 吸取0.02mL的马血清，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA_测定= （A_空白1- A_空白2）-（A_测定-A_对照）=（1.156-0.045）-（1.139-0.113）=0.085，标曲y=0.8502x+0.0217，x=0.074µmol/mL, 计算丙酮酸含量得：

丙酮酸含量（μmol/mL）=x×V样÷V样= x =0.074μmol/mL。

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