高铁螯合物还原酶（FCR）活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5915

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1、 显色液：临用前根据样本数量按照试剂一：试剂二：试剂三=50μL：50μL：50μL（150μL，1T）的比例配制显色液，充分混匀，现配现用。

2、 标准品：临用前加入0.71mL蒸馏水和10μL浓硫酸，配制成50μmol/mL Fe²⁺标准液。溶解好的标准品2-8℃可以保存2周。

3、 62.5nmol/mL标准溶液的配制：临用前取50μL 50μmol/mL Fe²⁺标准液和950μL蒸馏水混合配制成2.5μmol/mL 标准溶液；再吸取25μL 2.5μmol/mL（2500nmol/mL）和975μL蒸馏水混合配制成62.5nmol/mL标准溶液备用。

产品说明：

双子叶植物和非禾本科单子叶植物采用铁螯合还原反应的高效活化和吸收机制从土壤中获取铁。三价铁还原为二价铁后才能被植物吸收利用。在铁充足时，植物根部的三价铁氧化还原酶将Fe(III)-螯合物中的铁还原并将还原所得Fe²⁺转运通过细胞质膜进入根细胞内。高铁螯合物还原酶（Ferric chelate reductase，FCR，EC1.16.1.7）催化Fe³⁺还原为Fe²⁺，Fe²⁺和菲洛嗪形成紫色络合物，在562nm下有特征吸收峰。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、分析天平、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板、研钵/匀浆器、浓硫酸（95%-99% AR）、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：按质量（g）: 提取液体积（mL）1 : 5~10比例加入提取液（建议称取0.1g样本，加入1.0mL提取液），冰浴匀浆后，于4℃，8000g，离心10min，弃沉淀，取上清液置于冰上待测。

2. 液体样本：直接测定。若液体有浑浊则离心取上清测定。

二、测定步骤

1．可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至562nm，可见分光光度计用蒸馏水调零。

2．显色液临用前平衡至常温。

3．标准管测定

吸取50μL 62.5nmol/mL Fe²⁺标准液，加入150μL显色剂，充分混匀，测定562nm下的吸光度，记为A标准，此时Fe²⁺终浓度为15.625nmol/mL，标准管只需做1-2次。

4．空白管测定

吸取50μL蒸馏水，加入150μL显色剂，充分混匀，测定562nm下的吸光度，记为A空白，计算ΔA标准=A标准-A空白，空白管只需做1-2次。

5．操作表：（在微量玻璃比色皿或96孔板中以下试剂）

三、高铁螯合物还原酶（FCR）活性计算

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白在每mL体系中每分钟生成1nmol Fe²⁺定义为一个酶活力单位。

FCR活性(U/mg prot)= ΔA×C标÷ΔA标准×V总÷(Cpr×V样) ÷T=2.083×ΔA÷ΔA标准÷Cpr

（2）按样本质量计算：

单位的定义：每g组织在每mL体系中每分钟生成1nmol Fe²⁺定义为一个酶活力单位。

FCR活性(U/g 质量) =ΔA×C标÷ΔA标准×V反总÷(W÷V提取×V样) ÷T =2.083×ΔA÷ΔA标准÷W

C标：Fe²⁺标准液最终浓度，15.625nmol/mL；V反总：反应体系总体积，0.2mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，50μL=0.05mL；V提取：加入提取液体积，1mL； T：反应时间，30min；W：样本质量，g。

注意事项：

1、 如果∆A小于0.010或测定管吸光值接近空白管，可以增加样本量或者延长反应时间后再进行测定；如果∆A大于1或者A1大于1，建议将样本上清用提取液适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1、 称取0.1214g樱桃番茄，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA= A2-A1=0.665-0.127=0.538，ΔA标准=A标准-A空白=0.525-0.083=0.442，带入公式计算：

FCR活性(U/g 质量) =2.083×ΔA÷ΔA标准÷W=20.885 U/g 质量

2、 称取0.1002g闽南叶片，加入提取液进行冰浴匀浆，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算ΔA= A2-A1=0.188-0.104=0.084，ΔA标准=A标准-A空白=0.525-0.083=0.442，带入公式计算：

FCR活性(U/g 质量) =2.083×ΔA÷ΔA标准÷W=3.951U/g 质量

参考文献：

[1] Shabnam N , Kim M , Kim H .Iron (Ⅲ) oxide nanoparticles alleviate arsenic induced stunting in Vigna radiata[J].Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 183(Nov.).

[2 Kabir A H , Akther M S , Skalicky M ,et al.Downregulation of Zn-transporters along with Fe and redox imbalance causes growth and photosynthetic disturbance in Zn-deficient tomato[J].Scientific Reports, 2021, 11(1).

[3] Ojeda M , Schaffer B , Davies F S .Root and Leaf Ferric Chelate Reductase Activity in Pond Apple and

Soursop[J].Journal of Plant Nutrition, 2005, 27(8):1381-1393.

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