柠檬酸合酶
（CS）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC1065
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂五：临用前加入500 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2. 试剂六：临用前加入1.5 mL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明：
CS（EC 2.3.3.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体基质中，是三羧酸循环第一个限速酶，是三羧酸循环主要调控位点之一。
CS催化乙酰CoA和草酰乙酸产生柠檬酰辅*A，进一步水解产生柠檬酸；该反应促使DTNB转变成黄色的TNB，在412nm处有特征吸光值。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、研钵/匀浆器、可调节移液器、微量玻璃比色皿/96孔板和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

注意事项：
1、测定过程中样本和所有试剂在冰上放置，以免变性和失活。
2、比色皿中反应液的温度必须保持37℃或25℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃或25℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃或25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3、最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4、用96孔板测定时，根据测定管数量配制测定管工作液（试剂三、四、五、六）和对照管工作液（试剂三、四），因通过单位时间内吸光值变化计算酶活，不推荐同时测多个样本。
5、推荐使用样本蛋白浓度计算酶活，若用样本质量计算，则需加测胞浆提取物酶活，上清和沉淀酶活之和方为总酶活。
6、附：使用样本鲜重计算公式：
A、按微量玻璃比色皿计算
单位的定义：37℃或25℃下每g组织在反应体系中每分钟催化产生1 nmol TNB定义为一个酶活力单位。
CS上清（U/g 质量）=ΔA上清÷（ε×d）×V反总÷（W×V样本÷V提取）÷T=1061×ΔA上清÷W
CS沉淀（U/g 质量）=ΔA沉淀÷（ε×d）×V反总÷（W×V样本÷V样总）÷T=212×ΔA沉淀÷W
CS（U/g 质量）=CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W
ΔA上清：上清测定值；ΔA沉淀：沉淀测定值；ε：TNB的消光系数，13.6×10^-3mL/(nmol·cm)；V反总：反应体系总体积，0.2 mL；d：比色皿光径，1cm；V样本：加入的样本体积，0.007mL；V提取：提取液体积，1.01mL；V样总：溶解沉淀的总体积，0.202mL；T：反应时间，2min；W：样本质量，g。
B、按96孔板计算
将上述公式中的d=1cm改为d=0.6cm（96孔板光径）进行计算即可。
实验实例：

1. 取0.1g小鼠心脏样本加入1mL提取液和10μL试剂二进行匀浆研磨，取上清后再离心，取上清，取沉淀后加入200μL试剂一和2μL试剂二，之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测吸光度后计算上清中：ΔA1=A2-A1 =1.4577-0.8015=0.6562，ΔA1’=A2’-A1’=0.7842-0.7331=0.0511，ΔA上清=ΔA1-ΔA1’=0.6051；沉淀中：ΔA1= A2 -A1 =0.4166-0.1303=0.2863，ΔA1’=A2’-A1’=0，ΔA沉淀=ΔA1-ΔA1’=0.2863，按样本质量计算酶活得：CS（U/g 质量）= CS上清+CS沉淀=1061×ΔA上清÷W+212×ΔA沉淀÷W

= 1061×0.6051÷0.1+212×0.2863÷0.1=7027.067 U/g 质量。
相关发表文献：

1. Ming Song,Fangfang Chen,Yihui Li,et al. Trimetazidine restores the positive adaptation to exercise training by mitigating statin-induced skeletal muscle injury. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. November 2017;(IF10.754)

2. Zhang J, Lv J, Xie J, et al. Nitrogen Source Affects the Composition of Metabolites in Pepper (Capsicum annuum L.) and Regulates the Synthesis of Capsaicinoids through the GOGAT–GS Pathway[J]. Foods, 2020, 9(2): 150.

参考文献：
[1]  Agostinho F R, Réus G Z, Stringari R B, et al. Treatment with olanzapine, fluoxetine and olanzapine/fluoxetine alters citrate synthase activity in rat brain[J]. Neuroscience letters, 2011, 487(3): 278-281.
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