肉桂酸-4-羟化酶（C4H）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC4085
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前取一瓶粉剂加入2 mL乙醇溶解备用。2-8℃保存4周。

2. 试剂三：临用前取一瓶粉剂加入2 mL双蒸水充分溶解待用。现配现用。-20℃分装可保存4周，避免反复冻融。

产品说明：
C4H又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，是催化桂皮酸形成咖啡豆、香豆酸的酶。C4H多存在于高等植物、酵母、菌类中，属于细胞木质素合成途径中间的关键酶。
C4H催化肉桂酸和NADPH生成4-香豆酸盐和NADP，在340nm下测定NADPH的减少速率，即可反映C4H活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器、乙醇、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1、组织：称取约0.1g组织，加入1mL提取液进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心15分钟，取上清，置冰上待测。
2、细胞或细菌样本的制备：先收集细胞或细菌样本到离心管内，弃上清，按照每500万细胞或细菌加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（功率200W，超声3s，间隔10s，重复30次）。12000g，4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
二、测定步骤

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热30min，波长调至340nm，紫外分光光度计蒸馏水调零。

2. 加样表（微量石英比色皿/96孔UV板中分别加入）

充分混匀后立即测定10s时在340nm下的吸光度，记为A1，之后迅速将其放入37℃水浴或37℃培养箱中3min（若酶标仪带有控温功能，将温度调为37℃）。然后迅速拿出擦净后测定190s时的吸光度，记为A2。计算ΔA=A1-A2。

注意事项：
当ΔA大于0.4时，建议将样本用提取液稀释后测量；ΔA过小时，建议增加酶促反应时间（5min或10min）或增加加入的样本体积来测定。
实验实例：

1. 取0.1g黄豆（发芽）加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA=A1-A2=1.1227-0.9854=0.1373，按样本质量计算酶活得：C4H酶活（U/g质量）=535.91×ΔA÷W=535.91×0.1373÷0.1=735.80 U/g 质量。

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