L-乳酸（L-LA）含量检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC2235
规格：100T/48S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前按试剂二（V）：蒸馏水（V）=10μL：450μL的比例配制试剂二溶液，现用现配；

2. 试剂四：临用前每瓶加入3 mL 蒸馏水混匀，可分装后-20℃保存，避免反复冻融，-20℃保存4周；

3. 标准品：临用前加入1.04 mL蒸馏水配成100 μmol/mL 的标准溶液；2-8℃保存4周。

产品说明：
乳酸是生物体代谢过程中重要的中间产物，与糖代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及细胞内能量代谢密切相关，乳酸含量是评估糖元代谢的和有氧代谢的重要指标。乳酸在乳酸脱氢酶的作用下生成丙 酮酸，同时使NAD⁺还原生成NADH和H⁺，H⁺传递给PMS生成的PMSH₂还原MTT生成紫色物质，在570nm处有特征吸收峰。

技术指标：
低检出限：0.0771 μmol/mL
线性范围：0.078-5 μmol/mL
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：
天平、研钵/匀浆器、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96孔板、恒温水浴锅、乙醇和蒸馏水。 

操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

• 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织：按照质量（g）：提取液一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液一）加入提取液一，冰浴匀浆后于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁶个）：提取液一体积（mL）为5~10：1的比例（建议5×10⁶个细胞加入1mL提取液一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3min）；于4℃，12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，4℃ 12000g离心10min后取上清待测。

3. 血清（浆）等液体：取100μL液体加入1mL提取液一，4℃ 12000g离心10min，取0.8mL上清液，再缓慢加入0.15mL提取液二，缓慢吹打混匀至无气泡产生，12000g离心10min后取上清待测。

注意事项：

1. 
   

1. 
   

2. 如果测定吸光值超过线性范围吸光值，可以增加样本量或者稀释样本后再进行测定。

3. 提取液一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。如需测定蛋白含量，需另取样本。

4. 
   

实验实例：

1. 取0.1g兔心加入1mL提取液一进行匀浆研磨离心，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清后稀释5倍，之后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.591-0.069=0.522，根据标准曲线y=0.412x-0.0214，x=1.319，按样本质量计算含量得： L-LA含量（μmol/g 质量）= 1.1875×x÷W×稀释倍数=1.1875×1.319÷0.1×5=78.32 μmol/g质量。

2. 取100μL小鼠血清加入1mL提取液一，取0.8mL上清后加0.15mL提取液二，离心取上清，之后按照测定步骤操作，使用96孔板测得计算ΔA测定=A测定管-A对照管=0.572-0.211=0.361，根据标准曲线y=0.412x-0.0214，x=0.928，按照液体体积计算含量得： L-LA含量（μmol/mL）=13.0625×x=13.0625×0.928=12.122 μmol/mL。

相关发表文献：

1. Meixi Peng,Dan Yang,Yixuan Hou,et al.Intracellular citrate accumulation by oxidized ATM-mediated metabolism reprogramming via PFKP and CS enhances hypoxic breast cancer cell invasion and metastasis. Cell Death and Disease. March 2019;(IF5.959)

2. Xiaojin Luo,Weihua Shi，Haoming Yu,et al. Wearable Carbon Nanotube-Based BioSensors on Gloves for Lactate. Sensors. October 2018;(IF3.031)

3. Zhou F, Du J, Wang J. Albendazole inhibits HIF-1α-dependent glycolysis and VEGF expression in non-small cell lung cancer cells[J]. Molecular and cellular biochemistry, 2017, 428(1-2): 171-178.

参考文献：
[1] Jin Bingjun, Li Taiyuan, Zhang Chunfeng. Determination of lactic acid concentration in bovine blood by enzymatic method [J]. Chinese Journal of Veterinary Medicine, 1990, 16(07): 23-25.    [2] Eolbergrová J, MacMillan V, Siesjö B K. The effect of moderate and marked hypercapnia upon the energy state and upon the cytoplasmic NADH/NAD⁺ ratio of the rat brain[J]. Journal of neurochemistry, 1972, 19(11): 2497-2505.
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