磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒说明书
微量法
注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
货号：BC0535
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二A：临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

2. 试剂二B：临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

3. 试剂二C：临用前取一支加入0.5mL蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存2周，避免反复冻融；

4. 试剂二D：临用前加入1mL蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存4周，避免反复冻融；

5. 试剂三：临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为1μL:50μL（约5T）的体积比例充分混匀，现用现配；

6. 试剂四：临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为1μL:125μL（约12T）的体积比例充分混匀，现用现配；

7. 工作液的配制：根据样本量按试剂一：试剂二A：试剂二B：试剂二C：试剂二D =8mL：0.5mL：0.5mL：0.5mL：0.5mL（约55T）的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：
磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase，PFK，EC 2.7.1.11）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和ATP转化为果糖二磷酸和ADP，是糖酵解过程的关键调节酶之一。
PFK催化果糖-6-磷酸和ATP生成果糖-二磷酸和ADP，丙 酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映PFK活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔UV板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件
注意事项：

1. 测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。

2. 比色皿中反应液的温度必须保持37℃，取小烧杯一只装入一定量的37℃蒸馏水，将此烧杯放入37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3. 最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。

4. 不同匀浆组织中PFK活性不一样，若ΔA>0.5，则说明活性太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液，或缩短反应时间至2min或5min，使ΔA<0.5，以提高检测的灵敏度。注意同步修改计算公式。

实验实例：

1. 取0.1g黑麦草加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA=A1-A2=1.6086-1.2986=0.31，按样本质量计算酶活得：

PFK活性（U/g 质量）=535×ΔA÷W=535×0.31÷0.1=1658.5 U/g 质量。

1. 取0.1g桃叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算ΔA=A1-A2=1.7025-1.6159=0.0866，按样本质量计算酶活得：

PFK活性（U/g 质量）=535×ΔA÷W=535×0.057÷0.1=463.31 U/g 质量。
参考文献：

1. Papagianni M, Avramidis N. Lactococcus lactis as a cell factory: a twofold increase in phosphofructokinase activity results in a proportional increase in specific rates of glucose uptake and lactate formation[J]. Enzyme and microbial technology, 2011, 49(2): 197-202.

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