NAD-苹果酸脱氢酶（NAD-MDH）活性检测试剂盒说明书
微量法
货号：BC1045
规格：100T/96S
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂二：临用前加入360 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存；

2. 试剂三：临用前加入327 μL双蒸水，用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明：
MDH（EC 1.1.1.37）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，线粒体中MDH是TCA循环的关键酶之一，催化苹果酸形成草酰乙酸；相反，胞浆中MDH催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物，连接多条重要的代谢途径。因此，MDH在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色，包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性，MDH分为NAD^-依赖的MDH和NADP^-依赖的MDH，细菌中通常只含有NAD-MDH，在真核细胞中，NAD-MDH分布于细胞质和线粒体中。
NAD-MDH催化NADH还原草酰乙酸生成苹果酸，导致340nm处光吸收下降。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/ 96孔板（UV板）、研钵/匀浆器、蒸馏水。

操作步骤：具体操作步骤详见“产品资料"附件

注意事项：

1. 粗酶液的提取必须在0℃-4℃中操做完成，以防止酶变性失活。

2. 实验时，试剂二、试剂三和样本在冰上放置，以免变性和失活。

3. 使用光径为1cm的微量石英比色皿时当初始读值小于0.7或者ΔA大于0.5时建议稀释后测量。使用96孔UV板时当初始读值小于0.4或者ΔA大于0.3时建议稀释后测量。

4. 建议一人加样一人比色。因时间监测范围小，不推荐用96孔UV板同时测多个样本。

实验实例：

1. 取0.05g大鼠肝脏加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=0.8484-0.3068=0.5416，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7628-0.7583=0.0045，按样本质量计算酶活得：NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷W=6431×0.5371÷0.05=69082 U/g 质量。

2. 取0.05g柳树叶加入1mL提取液进行匀浆研磨，取上清后按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=0.7796-0.6917=0.0879，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7628-0.7583=0.0045，按样本质量计算酶活得：NAD-MDH（U/g 质量）=6431×(ΔA测定-ΔA空白) ÷W=6431×0.0834÷0.05=10727 U/g 质量。

3. 取5μL血浆直接按照测定步骤操作，使用微量石英比色皿测得计算ΔA测定管=A1测定-A2测定=0.8194-0.7959=0.0235，ΔA空白管=A1空白-A2空白=0.7628-0.7583=0.0045，按血清/血浆体积计算酶活得：

NAD-MDH（U/mL）=6431×(ΔA测定-ΔA空白)=6431×0.019=122 U/mL。
参考文献：

1. Yao Y X, Li M, Zhai H, et al. Isolation and characterization of an apple cytosolic malate dehydrogenase gene reveal its function in malate synthesis[J]. Journal of plant physiology, 2011, 168(5): 474-480.

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