丁酰胆*酯酶抑制剂活性检测试剂盒说明书

微量法

货号：BC5985

规格：100T/96S

产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系索莱宝工作人员。

溶液的配制：

1. 试剂一：临用前加入1.2mL蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂-20℃分装后可保存4周，避免反复冻融该试剂为冻干试剂，可能存在不同瓶间肉眼观察试剂量相差较大甚至量很少的现象，此现象不影响使用，实际质量相同。

2. 试剂四：临用前加入6mL试剂二，充分溶解，用不完的试剂-20℃可分装保存4周，避免反复冻融。

3. 试剂五：10mmol/L利凡斯的明溶液。临用前取15μL 10mmol/L利凡斯的明溶液，加入985μL蒸馏水，配制成0.15mmol/L利凡斯的明溶液，现用现配（此试剂用于阳性管实验，选做）。

产品说明：

丁酰胆*酯酶（Butyrylcholinesterase，BchE，EC3.1.1.8），又称血浆*碱酯酶，假性胆*酯酶，是一种丝*酸水解酶，由肝脏合成后进入血液，几乎存在于所有动物组织中。与乙酰胆*酯酶（AchE）相比，BchE能够有效水解较大的胆*酯，如丁酰胆*和苯甲酰胆*，而且可以清除有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药等神经毒剂的毒害作用。有研究表明，BchE可作为阿尔茨海默病治疗的重要靶点，BchE抑制剂被用于改善阿尔茨海默病患者记忆力减退、认知功能障碍等病征。

BchE催化丁酰胆*水解生成*碱，胆*与二硫代硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯甲酸（TNB），BchE抑制剂通过抑制BchE活性，减少丁酰胆*的水解。TNB在412nm处有吸收峰，可通过测定412nm处吸光度的变化，计算BchE抑制剂活性。

注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、天平、烘箱、粉碎仪/研钵/匀浆器、30-50目筛、超声清洗仪、离心机、水浴锅/恒温培养箱、微量玻璃比色皿/96孔板、可调式移液枪、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、 样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）

1. 组织样本：将样本烘干至恒重，粉碎，过30-50目筛之后，称取约0.1g，加入1mL提取液，用超声提取法进行提取，超声功率300W，60℃，提取30min。12000rpm，25℃，离心10min，取上清，用提取液定容至1mL，待测。

2. 粉剂样本：称取适量样本，加入适量提取液，配制成适宜浓度的溶液待测。

注：若粉剂样本不溶于提取液，可先用合适的溶剂溶解，配制成100×或者更大浓度的溶液，再用提取液稀释至1×浓度。

二、 测定步骤

1．可见分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长至412nm，分光光度计蒸馏水调零。

2．操作表：（在微量玻璃比色皿/96孔板中加入下列试剂）

三、丁酰胆*酯酶抑制剂活性计算

1. 抑制率计算

丁酰胆*酯酶抑制剂

抑制率（%）=（ΔA_空白-ΔA_测定）÷ΔA_空白×100%。

2. IC₅₀计算

IC₅₀，即抑制剂半抑制浓度。对于确定对BchE有抑制作用的样本，可配制成适当的浓度梯度，分别以样本浓度为横坐标，以抑制率为纵坐标作抑制曲线，以此计算得到抑制率为50%时的样本浓度，即IC₅₀。

注意事项：

1. 为保证实验结果的准确性和稳定性，请严格控制反应时间和操作时间。

2. 样本吸光度大于1.6或ΔA_测定接近ΔA_空白时，建议在样本处理步骤增加组织样本比例或将粉剂样本配制成更高浓度的溶液再进行测定。当ΔA_测定小于0.004时，可以将样本用提取液稀释后再进行测定。

3. 若用于比较不同试剂、提取物、药物或组织对BchE的抑制程度，必须将试剂、提取物、药物或组织匀浆配制成相同浓度进行比较。

实验实例：

1. 取0.1005g柚果皮样本（烘干），加入1mL提取液进行超声提取，离心后取上清，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_测定=（A’_测定-A_测定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.878-0.337）-（0.141-0.120）=0.520，计算抑制率得：

BchE抑制剂抑制率（%）=（0.975-0.520）÷0.975×100%=46.667%。

2. 取0.1014g柿果皮样本（烘干），加入1mL提取液进行超声提取，离心后取上清，稀释16倍后按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_测定=（A’_测定-A_测定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.581-0.127）-（0.141-0.120）=0.433，计算抑制率得：

BchE抑制剂抑制率（%）=（0.975-0.433）÷0.975×100%=55.590%。

3. 取10μL 0.15mmol/L利凡斯的明溶液，按照测定步骤操作，用96孔板测得计算：ΔA_空白=（A’_空白1-A_空白1）-（A’_空白2-A_空白2）=（1.129-0.133）-（0.141-0.120）=0.975，ΔA_测定=（A’_测定-A_测定）-（A’_空白2-A_空白2）=（0.631-0.126）-（0.141-0.120）=0.484，计算抑制率得：

BchE抑制剂抑制率（%）=（0.975-0.484）÷0.975×100%=50.359%。

参考文献：

[1] Ellman GL, Courtney KD, Andres V Jr. et al. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity [J]. Biochemical Pharmacology, 1961, 7(2): 88-95.

[2] Noor Atatreh, Sara Al Rawashdah, Shaikha S Al Neyadi. et al. Discovery of new butyrylcholinesterase inhibitors via structure-based virtual screening [J]. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 2019, 34(1): 1373-1379.

[3] Li Q, Chen Y, Xing S. et al. Highly Potent and Selective Butyrylcholinesterase Inhibitors for Cognitive Improvement and Neuroprotection [J]. Journal of Medicinal Chemistry, 2021, 64(10): 6856-6876.

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