生物治疗药物容易诱导抗药物抗体(ADA)的产生。有证据表明，蛋白质聚集物和颗粒具有增强免疫原性的能力，从而引发对蛋白质单体形式的免疫反应。

生物治疗蛋白的制造商通常通过一系列步骤来制备用于注射的药物，如:

1.蛋白质合成与纯化

2.在运输过程中用于稳定的冻干

3.注射前再造

虽然冻干的好处是它可以稳定蛋白质的运输，但目前还不清楚冻干蛋白在重组后是否会回到单体状态。如果由于这一过程而导致少量的蛋白质聚集，就有可能在患者的治疗过程中产生免疫反应。

开发一种简单的方法来测量聚集程度，使数据在重组后以大小与浓度的直方图显示，将有助于在处方过程中筛选这些药物。这种分析可以确保重组过程在没有大量聚集的情况 下释放单体。

粒子计数技术

有一些技术能够测量颗粒大小和浓度的大小范围的兴趣，以量化蛋白质聚集。光阻法是许多药学工作者所熟悉的方法，因为它是用于USP<788>颗粒物质注射剂和USP< 729> 测试，以测量脂类乳剂的尾部。但是经典的光阻传感器通常具有更低的粒径限制，接近1μm,而且对于许多蛋白质聚集样品，浓度限制太低。

新的PSS AccuSizer FX-Nano系统(如下图所示)被设计用于更小的颗粒尺寸和更高的浓度。这是通过使用两个传感器实现的: FX-Nano传感器可测量0.15-0.6μm和LE400传感器测量0.5-40μm。新型FX-Nano传感器使用聚焦光束来减少检测的总体积,从而增加了传感器的浓度限制。该传感器与SIS进样器耦合,修改后允许样品体积低至250μm。这种结构的结膜通过USP <787>治疗性蛋白注射中亚可见颗粒物质的所有要求。

聚合蛋白的大小和计数使用两个传感器，以覆盖0.15- 40um的动态范围。当LE传感器 单独使用时，可以从0.5 -400 μ m,这使得这个体系非常灵活。

数据1:  IgG过滤前后

在PBS中制备免疫球蛋白G (IgG)， ~ 150kda, 1%。样品未经稀释使用宾西泽FX- nano与FX和LE传感器和SIS进样器。结果如图1所示。总计#粒子计数= 109,343, 浓度= 9.7 x 10 粒子/毫升。

 图1:未过滤的IgG

样品还在Particle Sizing Systems Nicomp 380动态光散射(DLS)系统上进行了分析，如图2所示,以评估单体的大小，并大致了解聚合蛋白的大小。峰1(天然蛋白):14.6nm(99.6%总质量)。# 2(聚合达到max)：395nm（总质量0.4%）。这是在200-500纳米和更大的聚集体的尾部。

 图2：未过滤的1gG的DLS Nicomp 360数据

然后蛋白样品通过0.2μm过滤器，在Accuizer FX-Nano系统上再次分析，过滤前后对比结果如图3所示。PBS的结果也显示为黑色。

图3:过滤前(蓝色)和过滤后(红色)

数据2: 培育前后的IgG

用样品制备方法研究培育对IgG蛋白样品的影响。图4显示 了IgG样品在37°C培育前、培育1小时和6小时后的粒径分布。样品单独使用Accuizer FX系统测量。将聚合蛋白定义为>0.7μm, 其浓度分别为9.77、7.75、5.08 x 105颗/毫升。显然,这种聚集程度随着热培养的增加而减少，表明溶解改善。图5中展开了聚合的尾部以获得更多细节。

 图4:时间0(蓝色)，1小时(红色)， 6小时(黑色)

 图5:聚合的蛋白质尾部的扩展视图

数据3: 不同贮藏和加工条件下的蛋白质

一名使用者提供了一种未知的蛋白质。在FX-Nano 上分析了缓冲液和三种不同的制备/储存条件,以确定聚合蛋白的粒径和浓度。缓冲液和蛋白样品中> 0.19um颗粒的浓度见表1。图形结果以差分计数格式(图6)和累积格式(图7)显示。

 表1:缓冲液和三种蛋白样品的颗粒浓度

 图6:差异分布

 图7:累积分布

图8和图9显示了相同的聚合蛋白数据，但Y轴的浓度以对数标度表示，以更好地显示大浓度范围的结果。

图8: Differential distribution, log scale

图9:Cumulative distribution, log scale

结论：

该Accuizer FX-Nano提供了一种分析工具, 能够轻松量化蛋白质聚集物的大小和浓度。*的两个传感器方法涵盖了广泛的动态范围，需要提供详细的，高分辨率的aggre尾部视图封闭的蛋白质。准确的计数数据允许比较不同浓度的样品的结果。SIS取样器可以用于此应用所需的小样本量。此外，通过去除FX-Nano传感器，该系统可以用于注射中USP <787>和<788>的标准颗粒物。

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