免疫荧光染色实验服务

免疫荧光染色实验服务

一、制片

选无自发性荧光的石英玻片或普通优质玻片，洗净后浸泡于无水乙醇和乙氧基乙烷等量混合液中。用时取出用绸布擦净。将待检样品如组织块剪成适当大小印压于玻片上。也可采用冰冻切片或石蜡切片样品。

二、固定

除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，--般均应固定。

固定的作用有三:

1.防止标本从玻片上脱落。

2.除去防碍抗原抗体结合的类脂，使抗原抗体结合物易于获得良好的染色结果。

3.固定的标本易于保存，如组织切片固定后在-20%C下可保存一年而不改变其染色特性。

标本的固定原则是:

1.不能损伤细胞内的抗原。

2.不能凝集蛋白质。

3.不能损伤细胞形态。

4.固定后应保持细胞膜的通透性，以允许抗体进入与抗原结合。

三、水洗

固定后以冷的0.01 Mol/L pH7 4PBS液浸泡冲洗，后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。

四、染色

染色分直接染色法与间接染色法。

1.材料与试剂

(1)荧光抗体，稀释至应用浓度。

(2) 0.01 Mol/L pH7 .4PBS液

(3) 9份优质甘油加1份pH7 .4PBS液即为甘油缓冲液。甘油有减少非特异性荧光的作用。

(4)带盖方盘。

2. 直接染色法

(1)将固定好的玻片置于湿盘中，滴加荧光抗体染色液，以覆盖为度，加盖，37°C感做30min~45min.

(2) PBS冲洗3次，每次冲洗3 min,即3x3冲洗。

(3)蒸馏水冲洗。

(4)滴甘油缓冲液一滴，封片，荧光显微镜检查。

3.间接染色法

(1) 检查抗原:

①取固定标本，加已知的免疫血清，37°C孵育30 min。

②以PBS液3x3冲洗。

③再加荧光标记的抗抗体，37°C孵育30 min。

④PBS 3x3冲洗。

⑤H2O冲洗，凉干。

⑥加甘油缓冲液，封片、镜检。

(2)检查抗体:

①兔疫后动物的淋巴组织涂片，自然干燥，甲醇固定。

②滴加相应抗原液(按1: 100~1: 500稀释)， 37°C孵育30 min.

③PBS液3x3冲洗。

④加荧光抗体，37°C孵育30 min.

⑤PBS液3x3冲洗。

⑥水洗，干。

⑦加甘油缓冲液，封片、镜检。

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