开发全自动多级过滤分离外泌体仪器，并通过提取人自体脂肪干细胞来源外泌体进行性能评价。方法：确定仪器分离工艺流程，设计仪器结构，完成仪器软硬件开发；从患者获取自体脂肪，消化后获取脂肪干细胞并进行培养传代，收集第三代脂肪干细胞培养上清液并初步离心，取上清加入第一级储液罐中，通过仪器过滤，将获取的第三级滤液进行离心并提取外泌体。通过透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）观察外泌体的形态，进行纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA），分析粒径、颗粒浓度，并通过蛋白质印迹法（Western Blot）检测脂肪干细胞来源外泌体的特异性蛋白表达，表达指标包括CD63、CD81、TSG101，同时检测GM130判断检测样品中囊泡被污染的程度。结果：完成了全自动多级过滤分离外泌体仪器的开发，由仪器进行过滤浓缩并经过离心后提取的脂肪干细胞来源外泌体，在透射电子显微镜的观察下呈圆杯状，通过纳米颗粒跟踪分析得到的外泌体大部分处于50nm-200nm之间，蛋白质印迹法检测显示：提取的外泌体中有CD63、CD81、TSG101的表达，外泌体获得量达到75%，囊泡污染情况处于正常范围内。结论：全自动多级过滤分离外泌体仪器能实现外泌体高效快速分离，达到了临床应用的要求，为临床外泌体的疾病治疗提供了有力的支撑。

关键词：外泌体；脂肪干细胞；过滤；浓缩；提取

Multistage Filtration Based Fully Automated Exosomes Separation Instrument and Its Performance Evaluation

Zeng Yangtian¹ Zheng Yi² Liu Kai^2* Li Hong^1*

1(Hangzhou Baiqiao Medical Technology Co.,Ltd., Hangzhou 310018)

2 (Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai 200011)

3 (EVERFINE Test and Calibration Technology Co., Ltd, Hangzhou, Hangzhou 310053)

Abstract: Objective: to develop a fully automated multistage filtration instrument for the separation of exosomes and to evaluate the performance by extracting human autologous adipose-derived stem cells(ADSCs) exosomes. Methods: To determine the instrument separation process, design the instrument structure and complete the instrument development of both hardware and software; to obtain and digest the autologous fat from patients, obtain and subculture the adipose-derived stem cells, collect the supernatant of the third generation adipose-derived stem cell culture and make initial centrifugation, add the supernatant to the first reservoir then filter through the instrument, centrifuge the obtained third stage filtrate and extract exosomes. The morphology of the exosomes was observed by Transmission Electron Microscope (TEM). Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) was performed to analyze particle size and concentration. Western Blot (WB)was used to detect the specific protein expression of the adipose-derived stem cells exosomes, which including CD63, CD81, TSG101 and GM130.And the Western Blot Method also was used to detect the contamination extent of vesicles in the assay samples. Results: The development of a fully automated multistage filtration and separation instrument for exosomes was completed. The adipose-derived stem cell exosomes, which extracted by the instrument after filtration and concentration and centrifugation, were observed in a circular-cup shape by TEM. Most of the exosomes obtained by NTA were in the range of 50 nm-200 nm. WB showed that the extracted exosomes contained the expression of CD63, CD81, TSG101 and CD81. Exosomes were obtained up to 75% and vesicle contamination was within the normal range. Conclusion: The fully automated multistage filtration and separation of exosomes instrument can achieve efficient and rapid separation of exosomes, which meets the requirements of clinical application and provides a strong support for clinical exosomes in disease treatment.

Keywords: Exosomes; Adipose-Derived Stem Cells; Filtration; Concentration; Extraction

引言

外泌体（exosome）是直径在30～150nm的胞外囊泡^[1-3]，研究^[4-8]表明，外泌体广泛存在于尿液、胸腹腔积液、乳汁、唾液等体液中，很多细胞可以分泌外泌体，如MSCs、血细胞、内皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞等。外泌体携带大量胞内和胞外的生物信息，可作为细胞通讯和细胞外基质重塑的媒介，与人类健康和疾病息息相关^[9-10]，通过雾化吸入MSC-EVs给药途径对于急性呼吸窘迫综合征的治疗有重大意义^[11]；朱红艳^[12]课题组研究表明：CBSA/siS100A4能显著抑制恶性乳腺癌细胞的生长；马陶陶^[13]团队揭示：外泌体介导肾小管上皮细胞与巨噬细胞之间交互对话在糖尿病肾病治疗进程中发挥重要作用；张松英^[14]教授团队发现：通过调控蜕膜NK细胞（母源性）的代谢水平从而改善蜕膜NK细胞分泌胎盘发育所需因子的水平。正是因为近些年来外泌体在临床诊断、疾病治疗、组织再生等方面逐渐凸显出重要的价值，世界各国研究者对于外泌体特殊性质、结构的研究愈发深入。

传统的外泌体分离方法有超速离心法、过滤法、免疫磁珠法、微流控芯片等^[15]，超速离心法因为仪器设备昂贵难以大范围普及，免疫磁珠法由于夹杂其他外来成分难以进行临床应用，微流控芯片法虽然分离纯度高，但是提取量很小，难以大量推广，过滤法虽然技术成熟，但是目前处于手工处理阶段，费劲、费时且容易造成污染^[16-17]。

本文针对过滤法进行改进，对过滤孔径、过滤级数进行了完善，对整个过滤过程进行智能控制开发，以期达到适应临床高效、快速、安全应用的要求，并对仪器的外泌体制备效果进行了实验评价。

1 方法

1.1 仪器设计

1.1.1 仪器总体组成

仪器总体由两个储液罐、一个多级过滤单元、一个电机驱动器、柱塞泵、两个压力传感器、一个电机、直线运动机构、触摸屏等部分组成（图1）。整体由PLC与数据采集模块控制，压力传感器的数值实时在触摸屏上显示，经由触摸屏实现人机交互，仪器有自动和人工两种模式，根据工作场景进行切换。

1.1.2 仪器工作流程

使用仪器对目标液体浓缩的流程如图2所示：在一号储液罐中加入液体，开关上电，控制器控制电机驱动器，由电机驱动器控制电机启停，当电机开启，直线运动机构带动柱塞泵运动，吸液管将一号储液罐中的液体吸入后，经管路排入多级过滤单元，多级过滤单元的入口处和出口处装有压力传感器，通过实时检测一级稳压室和二级稳压室压力传感器的差值，根据差值大小来控制柱塞泵的开闭时间使得多级过滤单元内的压差恒定。致使液体能通过多级过滤单元，以达到自动过滤不同直径微粒的目的，仪器运行结束后，将直径小于多级过滤单元最底层滤膜直径的微粒和废液通过终端管路排入二号储液罐中，实验人员可以根据需要在多级过滤单元中获取目标产物。

图1全自动外泌体提取浓缩仪

Fig.1 Automatic Exosome Filtration Instrument

图2仪器工作流程图

Fig.2 Instrument work flow chart

1.2 仪器性能评价

1.2.1 实验材料

1.2.1.1实验用主要试剂

脂肪干细胞培养添加剂（UltraGRO^TM，AventaCell BioMedical，美国）；PBS（Gibco，美国）；0.25%胰酶（Gibco，美国）；胎牛血清（Gibco，美国）；三抗（Gibco，美国）；α-MEM、低糖与高糖DMEM（Gibco，美国）；胶原酶（Collagenase NB4，Serva，德国）； BCA蛋白定量试剂盒（碧云天，中国）。

1.2.1.2实验用主要仪器

一次性无菌10 cm培养皿（BD，美国）；100 kDa超滤管（Milipore，美国）；超净工作台（苏州净化设备有限公司，中国）；酶标仪（Thermo Fisher Scientific，美国）；微量电子秤（隆成仪器设备有限公司，中国）；流式细胞仪（Beckman，美国）；温度可调节台式离心机(Thermo Fisher Scientific，美国);血球计数板（上海市求精生化试剂仪器有限公司，中国）；温度可调节摇床（太仓市华美生化仪器厂，中国）；恒温水浴锅（上海赫田科学仪器有限公司，中国）。

1.2.2 实验方法

1.2.2.1脂肪干细胞的分离培养

本研究的脂肪来源于腹部或大腿内侧，为患者行抽脂术后的废弃脂肪。患者已签署知情同意书，同意捐献废弃脂肪用于医学研究，研究方案已经过上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准。

获取捐赠脂肪后，通过胶原酶消化脂肪，离心后提取原代脂肪干细胞。脂肪干细胞接种于含有脂肪干细胞培养添加剂的α-MEM培养基的10cm培养皿中，于5%CO₂，37℃条件下培养。细胞接近80%-90%融合时，使用含EDTA的0.25%胰酶消化细胞进行传代。使用第3代脂肪干细胞进行外泌体提取。

1.2.2.2脂肪干细胞来源外泌体提取

将收集第3代脂肪干细胞上清液倒入外泌体提取仪器进液罐中，使用仪器进行过滤操作。将收获的滤液加入100kDa的milipore超滤管中，超滤法提取外泌体。以3000g，15-20min，4℃条件离心，至超滤管内管上清液几乎全被离心下去，再用PBS洗涤一次，离心至内管仅剩余200-500μL含有外泌体的PBS。离心完成后，吸出含有外泌体的PBS，保存在4℃冰箱。

1.2.2.3脂肪干细胞来源外泌体鉴定

就目前的分离方法而言，很难得到特别纯净并且单一的外泌体，所以需要对经仪器浓缩后离心所得到的外泌体鉴定。本研究根据国际细胞外囊泡学会制订的标准采取三种方法进行鉴定，以保证鉴定的准确性。①透射电子显微镜（TEM）观察预处理后外泌体的形态^[18];②基于尺寸的纳米颗粒跟踪分析（NTA）：用光束照射外泌体中的粒子，通过粒子的散射光和布朗运动来记录每个粒子的路径，并且能确定粒子运动的平均速度和扩散系数，再经由数学计算得出外泌体的浓度和尺寸分布^[19];③使用蛋白质印迹法（Western Blot）检测外泌体表面的特异性蛋白marker ^[20]。

1.2.3 主要观察指标

①透射电子显微镜观测脂肪干细胞来源外泌体形态；②纳米颗粒跟踪分析，分析获取外泌体粒径和浓度；③蛋白质印迹法鉴定脂肪干细胞来源外泌体表达蛋白。

2 结果

2.1 脂肪干细胞形态

图3（a）为清洗纯化的脂肪，图3（b）为第三代的人脂肪干细胞在倒置显微镜下形态学观察呈长梭型。

2.2 外泌体透射电子显微镜鉴定结果

如图4（a）所示,在透射电子显微镜下脂肪干细胞来源外泌体大小在30nm-200nm之间，形态呈外泌体典型的圆杯状。

2.3 外泌体标志物蛋白质印迹法鉴定结果

在国际细胞外囊泡学会所标准^[21]中，必须包含细胞内体或外泌体质膜蛋白、与外泌体分泌相关的胞质蛋白，并排除一个非外泌体结构或相关的广域细胞质蛋白，该囊泡才能称之为外泌体，如图4（b）所示蛋白质印迹法检测到外泌体质膜蛋白CD63、CD81的表达以及分泌相关的ESCRT复合体蛋白中TSG101的表达，而几乎不表达高尔基体蛋白GM130，证明所分离的产物含有外泌体，其纯度较高。

2.4 外泌体纳米颗粒跟踪分析结果

如图5所示，通过纳米颗粒追踪分析所得到的颗粒粒径分布集中在30nm-200nm之间，颗粒的浓度结果，符合外泌体粒径特征^[22]。

图3 实验材料。（a）实验所用脂肪；（b）人脂肪干细胞的形态

Fig.3 Experimental materials.(a)Fat used in experiments；(b)Morphology of human adipose stem cells

图4外泌体形态与特异性蛋白鉴定。(a)透射电子显微镜显示的外泌体的形态特征;(b)蛋白质印迹法检测外泌体蛋白表达

Fig.4 Exosome morphology and specific protein identification.(a)Morphological characteristics of exosomes displayed by transmission electron microscopy;(b)Western blotting to detect exosome protein expression

图5 NTA检测外泌体粒径分布
Fig.5 NTA detection of exosome particle size distribution

3 讨论

对于多级过滤的全自动外泌体分离仪器进行的性能评价实验，采用自体脂肪干细胞作为原材料，以自体脂肪干细胞提取外泌体的临床意义在于：自体脂肪来源广泛，且容易获取，同时不会产生排异性，便于应用。同时全自动多级过滤分离外泌体仪器采用非接触式设计，加入了智能控制闭环设计，能有效的节省人工成本，使得提取的外泌体纯度高、无污染，达到临床所需外泌体标准。从实验评价结果来看通过对脂肪干细胞来源外泌体的浓缩，离心提取，并经过检测外泌体的三个标准方法鉴定：提取微粒是外泌体，并且污染度处于正常范围内，证明全自动外泌体过滤仪器对含外泌体的上清过滤浓缩，所得浓缩液进行分离可得到完整外泌体，外泌体提取所需处理时间远小于传统提取方法，达到临床应用的要求。

该仪器的完成能实现外泌体不同亚群颗粒大小（30-150nm）的精准细分提取，为研究外泌体亚群结构与功能的关系提供了有价值的工具，为临床治疗提供了快速高效省力的手段，目前该仪器仍然存在一定的问题，部分外泌体会黏附于滤膜上导致产物损失以及活性丧失。在接下来的研究，会进一步改进外泌体提取仪，采用切向流等新型过滤方法，对该缺点进行纠正，减少浓缩液的浪费，以期达到更高的外泌体获得量。

4 结论

全自动多级过滤分离外泌体仪器能实现外泌体高效快速分离，达到了临床应用的要求，为临床外泌体的疾病治疗提供了有力的支撑。

参考文献

[1] Raposo G,Stoorvogel W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends.[J]. The Journal of cell biology,2013,200(4).

[2] Lee Y,El A S,Wood MJA. Exosomes and microvesicles: extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy.[J]. Human molecular genetics,2012,21(R1).

[3] Marqués-García F,Isidoro-García M. Protocols for Exosome Isolation and RNA Profiling.[J]. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.),2016,1434.

[4] Li P,Kaslan M,Lee SH,et al. Progress in exosome isolation tech-niques[J]. Theranostics,2017,7( 3) : 789-804.

[5] Clark DJ,Fondrie WE,Liao Z,et al. Redefining the breast cancer exosome proteome by tandem mass tag quantitative proteomics and m*riate cluster analysis[J]. Anal Chem,2015,87(20) : 10462-10469.

[6] Yu B,Zhang X,Li X. Exosomes derived from mesenchymal stem cell[J]. Int J Mol Sci,2014,15(3) : 4142-4157.

[7] 叶冬熳,于韬. 肿瘤外泌体的提取与鉴定[J]. 现代肿瘤医学,2018,26(20),3341-3343.

[8] Chan BD，Wong WY,Lee MM,et al. Exosomes in inflammation and inflammatory disease[J]. Proteomics,2019,13: e1800149.

[9] MATHIEU M, MARTIN-JAULAR L, LAVIEU G, et al. Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication [J]. Nat Cell Biol, 2019, 21(1): 9-17.

[10] SHU S, YANG Y, ALLEN C L, et al. Purity and yield of melanoma exosomes are dependent on isolation method [J]. J Extracell Vesicles, 2020, 9(1): 1692401.

[11] Shi MM, Yang QY, Monsel A, et al. Preclinical efficacy and clinical safety of clinical-grade nebulized allogenic adipose mesenchymal stromal cells-derived extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 2021;10(10):e12134.

[12] Zhao L, Gu C, Gan Y, Shao L, Chen H, Zhu H. Exosome-mediated siRNA delivery to suppress postoperative breast cancer metastasis. J Control Release. 2020;318:1-15.

[13] Jiang WJ, Xu CT, Du CL, et al. Tubular epithelial cell-to-macrophage communication forms a negative feedback loop via extracellular vesicle transfer to promote renal inflammation and apoptosis in diabetic nephropathy. Theranostics. 2022;12(1):324-339.

[14] Jiang L, Fei H, Jin X, et al. Extracellular Vesicle-Mediated Secretion of HLA-E by Trophoblasts Maintains Pregnancy by Regulating the Metabolism of Decidual NK Cells. Int J Biol Sci. 2021;17(15):4377-4395.

[15] WEN S W, LIMA L G, LOBB R J, et al. Breast cancer-derived exosomes reflect the cell-of-origin phenotype [J]. Proteomics, 2019, 19(8): e1800180.

[16] Yang Dongbin,Zhang Weihong,Zhang Huanyun,Zhang Fengqiu,Chen Lanmei,Ma Lixia,Larcher Leon M,Chen Suxiang,Liu Nan,Zhao Qingxia,Tran Phuong H L,Chen Changying,Veedu Rakesh N,Wang Tao. Progress, opportunity, and perspective on exosome isolation - efforts for efficient exosome-based theranostics.[J]. Theranostics,2020,10(8).

[17] 白俊,任军,王均,张红梅,杨静悦,张利旺.离心过滤法提取外切体的实验研究[J].第四军医大学学报,2004(10):890-892.

[18] Lässer C,Eldh M,Lötvall J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.[J]. Journal of visualized experiments : JoVE,2012(59).

[19] Xiao-Xia Yang,Chao Sun,Lei Wang,Xiu-Li Guo. New insight into isolation, identification techniques and medical applications of exosomes[J]. Journal of Controlled Release,2019,308(C).

[20] Théry C,Amigorena S,Raposo G,Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.[J].Current protocols in cell biology,2006,Chapter 3(1).

[21] Théry C, Witwer KW, Aikawa E, et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. J Extracell Vesicles. 2018;7(1):1535750. Published 2018 Nov 23. doi:10.1080/20013078.2018.1535750

[22] 王帅,李超然,章茜茹,黄桂林.人尿源性干细胞来源外泌体的提取及鉴定[J].中国组织工程研究,2022,26(13):2056-2061.