氨基比林-N-去甲基化酶测试盒 P450系列

氨基比林-N-脱甲基酶（AND）试剂盒说明书

可见分光光度法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。

测定原理：

AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计、普通离心机， 超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL 玻璃比色皿、

蒸馏水、 无水乙醇和冰。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加50mL蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色瓶），4℃避光保存。临用前加入2.6 mL无水乙醇，充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入2.6 mL蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，室温保存。临用前加蒸馏水10mL充分溶解。

试剂六：液体×1 瓶，室温保存。

试剂七：液体×1 瓶，4℃保存。

标准液：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前取1.5mL EP管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1 mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4℃离心30min，取上清液转入超速离心管。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min，弃上清液。

4、终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。 该待测液需当天使用。

AND 活性测定操作：

1.分光光度计预热30min，调节波长到412nm，蒸馏水调零。

2.试剂二置于37℃水浴中预热 30min。

3.对照管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL 蒸馏水，

混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入175μL 试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入175μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm 离心5min；取新的EP管，加入500μ上清液，500μL试剂七，混匀后60 ℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm 测定光吸收，记为A对照管。

4.测定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL试剂四，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入175μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入175μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm 离心5min；取1支新EP管，加入 500μL上清液，500μL试剂七，混匀后60 ℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm 测定光吸收，记为A测定管。

5.标准管：取1支EP管，加入500μL标准品，500μL试剂七，混匀后60 ℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm 测定光吸收，记为A标准管。

注意：每个样品都需要做对照管。