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在4月17日普诺赛直播间中，徐老师从诱导分化步骤、细胞状态及密度、试剂配置及保存、诱导结果展示4个方面为大家详细介绍了间充质干细胞成脂、成骨、成软骨诱导分化。直播回放请点击微信公众号菜单栏【资料中心】-【往期直播回放】查看，或在B站搜索“普诺赛生物”，点击最新视频观看学习。
本期直播答疑，我们从直播间几十个提问中，筛选出部分代表性问题，并做了详细解答。若有其他问题，欢迎大家在推文底部留言，或点击微信公众号菜单栏【快速查询】-【在线咨询】，我们将在线解答。
1
成脂诱导前不需要接触抑制2天吗？有的文献说必须要接触抑制细胞才能分化。
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可根据当前的细胞状态以及使用的诱导试剂来决定是否接触抑制；
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使用普诺赛的成脂诱导分化培养基诱导细胞时，不需要接触抑制2天。在细胞接种后，密度达到95%-100%时，即可开始诱导；
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诱导期间细胞是在缓慢增殖和诱导分化的。在这个过程中，细胞会逐渐退出生长期，同时也保证了细胞处于最佳状态开始分化。
2
2.油红O染色液过滤用什么滤纸？
使用0.22 μm或0.45 μm的尼龙材质滤膜或中性滤纸进行过滤，去除油红O染色液中的杂质。
3
AB液培养交替时，需要用PBS充分洗涤吗？推荐的洗涤次数是？
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在成脂诱导过程中，A液和B液交替换液；
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换液时，可以用PBS洗涤细胞1次，但需要注意操作时清洗细胞的次数越多，越容易造成细胞卷边漂浮；
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若操作熟练且细胞状态较好，可以尽可能的吸去A液，然后再沿着孔壁缓慢加入预热好的新鲜B液，反之亦然；若操作不熟练，可严格按照以下操作：用PBS 清洗细胞1次，换液时可先吸出大部分培养基或PBS缓冲液丢弃，留少量原液在孔板内作为缓冲，接着沿孔壁缓慢加入要更换的预热新鲜培养基。
4
3T3细胞可以用于成脂诱导吗？诱导流程是和间充质干细胞成脂诱导的一样吗？MC3T3-E1细胞也是按照间充质干细胞成骨诱导步骤进行诱导吗？
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3T3-L1(小鼠胚胎成纤维细胞)细胞可进行成脂诱导实验，普诺赛也有配套的成脂诱导分化培养基（货号：PD-031），具体步骤可以参考配套诱导分化试剂的说明书；
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MC3T3-E1 Subclone 14 (小鼠颅顶前骨细胞亚克隆14)细胞可用于成骨诱导实验，普诺赛也有配套的成骨诱导分化培养基（货号：PD-033），具体步骤可以参考配套诱导分化试剂的说明书。
5
在诱导过程中拍照要打开盖子吗？如何通过观察细胞，后续进行诱导条件调整？
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如果是在诱导过程中拍照观察细胞状态，请不要打开盖子，防止细胞污染，影响后续细胞的状态；
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诱导过程中可通过镜下观察细胞状态，比如细胞是否出现卷边漂浮、碎裂、污染等情况来判断诱导过程是否顺利；
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若诱导过程中，细胞出现轻微卷边现象，在换液过程中要更加轻柔，可留少量原液作为缓冲，培养基37℃复温后再使用；或者使用包被过的孔板进行诱导，增强细胞的吸附性，减少卷边漂浮的情况；
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若发现污染情况，请立即排查试剂、耗材等污染源，小心处理已经污染的板子，防止污染其他孔板；
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实验开始时，建议多做几个单独孔板的重复组。在诱导后期，可通过镜下观察和染色来判断诱导实验是否成功。
6
旧包装诱导剂的哪些成分需要-20℃保存？也是不能反复冻融的吗？
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旧包装的诱导试剂保存条件可参照说明书和试剂管上标签备注的保存条件进行保存；
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旧包装的成骨诱导试剂中：FBS、谷氨酰胺、青链霉素、β-甘油磷酸钠、抗坏血酸和地塞米松B均需要-20℃保存；不建议反复冻融，若一次用不完可分装后冻存；
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旧包装的成脂诱导试剂中：FBS、谷氨酰胺、青链霉素、胰岛素、IBMX、罗格列酮和地塞米松A均需要-20℃保存；不建议反复冻融，若一次用不完可分装后冻存；
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旧包装的成软骨诱导试剂中：丙酮酸钠、ITS添加物、TGF-β3、抗坏血酸、脯氨酸、地塞米松B和青链霉素均需要-20℃保存；不建议反复冻融，若一次用不完可分装后冻存。
7
成骨的各种试剂也需要预热吗？
成骨诱导分化培养基配置完成后，使用前需37℃复温半小时以上，手感温热即可使用。预热的主要目的是为了避免过大温差对细胞造成刺激，导致细胞收缩、卷边甚至脱壁，影响后续实验结果。
8
成骨诱导培养基自己配制好配吗？
如果购买的是普诺赛配套的成骨诱导分化培养基，可按照说明书的配比添加相应成分配置即可，配置简单。如果是参考文献中的配方自己配置诱导试剂，这个诱导效果就不好评估了，建议配置后先进行预实验检测下诱导效果。
9
为什么要包被呢？细胞诱导久了容易聚集怎么解决呢？
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包被是为了增强器皿的吸附性，从而使细胞能够更好地展开，贴壁更牢，有效预防在诱导过程中细胞出现卷边或漂浮的情况；
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若细胞诱导时间长了，出现聚集的情况，老师在进行实验时可注意提前包被孔板、控制初始细胞接入量、细胞铺板均匀、换液轻柔、培养基复温等细节，尽量减少对细胞的刺激。
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拍照有什么注意事项吗？
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在诱导过程中拍照时，请确保调整好焦距，并选择合适的位置来拍摄不同倍镜下的细胞图片；
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染色后拍照时，请注意不同显微镜可能拍出略有差异的颜色。因此，需要仔细观察镜下颜色，确定拍出的染色图没问题。同时清洗完染液后，可留适量的PBS，以减少光圈的出现，从而呈现出更好的效果图。
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成软骨诱导完成后，进行包埋切片，切片是切多少微米的呢?我的球每次培养都很小，直径都没有1mm不知道是不是正常的，切片也只能切两三片，扫描也看不清楚，是为什么呢？
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软骨球切片厚度为3~5 μm，诱导结束后的软骨球直径大概在1~2 mm左右；
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开始诱导的细胞量需要严格控制在2.5~3*105 cells/0.5 mL/管；
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细胞量太多的话，球过大，诱导过程中可能会导致一些细胞死亡，球破裂；细胞量太少的话可能难以形成球，即便形成了较小的软骨球，后续操作也不好进行；
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培养的球直径比较小，可能原因是初始细胞量较少、诱导时间短、没有诱导成功等。切片厚度可以控制在4 μm，切片正常的话，肉眼可观察到有一个很小的软骨球片，呈小圆饼状，染色后肉眼可见更加明显。
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这三个诱导，原代细胞都要用3代以内细胞么？
原代细胞是组织现提取分离的，体外培养代次有限，且随着细胞代次的增加，细胞的增殖速度以及状态也会慢慢变差。建议使用三代以内的细胞开始诱导，在细胞状态最佳的时候进行实验，做出来的结果也会相对更好。
13
人细胞的成软骨分化试剂盒可以用于小鼠的细胞吗？
建议使用对应种属的成软骨诱导分化培养基，效果最-佳。但也有相关资料显示，成软骨诱导分化培养基对种属的要求没有那么严格，一般人的成软骨诱导分化培养基也可以用于小鼠。然而诱导过程中的影响因素较多，如果混用的话，建议先做预实验进行摸索。
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成软骨的鉴定，除了染色，有没有什么特异的靶标？
软骨结构复杂，主要是由一些基质成分组成，包括II 型、IX 型、X I型胶原和一些蛋白多聚糖，其中以II型胶原（Collagen II）和糖胺聚糖为主。成软骨诱导过程中会生成蛋白多聚糖和Collagen II等细胞外基质，可通过免疫荧光染色、甲苯胺蓝/阿利辛蓝染色、qRT-PCR 检测成软骨特异指标Ⅱ型胶原、蛋白多糖和成软骨转录因子 SOX9 的基因表达及蛋白合成情况，具体可参考文献。
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