ICP0248 96T 蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性检测试剂盒

蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶检测试剂盒

[试剂盒简介]

蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶（Protein Serine/Threonine Kinase, STK）是一种能使蛋白质中的丝氨酸或苏氨酸残基上的羟基磷酸化的酶，涉及控制细胞增殖，分化和致癌作用的信号转导途径，具有非常重要生理功能。加拿大ImmuneChem自主研发的蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶检测试剂盒（STK检测试剂盒）采用非放射性检测技术，为筛选STK的抑制剂或激活剂以及对纯化或部分纯化的STK的酶活性定量检测提供了一种安全，快速和可靠的方法。

     本检测试剂盒基于固相酶联免疫吸附测定（ELISA）的原理，利用STK的特异性多肽底物和能特异性识别磷酸化底物的多克隆抗体，检测液相中的STK活性。具体方法如下：在微孔板上预先包被STK的特异性多肽底物，将含有STK激酶的待测样品加入相应的孔中，并加入ATP开始底物磷酸化反应。反应结束后，向孔中加入特异性抗体以结合特定磷酸化的底物，随后特异性抗体被过氧化物酶（HRP）偶联的二抗结合。而偶联的HRP可作用于四甲基联苯胺底物（TMB）显色，显色过程被酸性终止液终止后，在450nm处用酶标仪测定颜色强度，其颜色强度的与STK的酶活性成正比关系 （图1）。

图1  STK检测试剂盒分析原理

[应用范围]

1.  含有单一STK的纯化或部分纯化的激酶样品的活性测定

2.  筛选STK的抑制剂或激活剂

        表1是经过检测验证可用本STK检测试剂盒的激酶列表，但由于研究有限，未列入表中的其它STK也可能用本试剂盒检测。

[方法概要]

1.  室温平衡：底物微孔板，抗体稀释缓冲液，酶反应稀释缓冲液，TMB底物和终止液

2.  将60 μL待测样品加入底物微孔板相应的孔中

3.  在每个孔中加入10 μL ATP溶液，开始底物磷酸化反应

4.  37°C孵育30-60分钟

5.  倒去每个孔中的液体，终止反应

6.  用300 μL 1X洗涤缓冲液洗孔4次

7.  在每个孔中加60 μL特异性磷酸化底物抗体溶液

8.  室温孵育60分钟

9.  用300 μL 1X洗涤缓冲液洗孔4次

10.  在每个孔中加入60 μL抗兔IgG: HRP工作液

11.  室温孵育30分钟

12.  用300μL 1X洗涤缓冲液洗孔4次

13.  在每个孔中加入60 μL TMB底物

14.  室温显色15-30分钟，显色时间根据颜色强度变化确定

15.  在每个孔中加入60 μL终止液

16.  测量450nm处的吸光度

[警告]

    本检测试剂盒仅供实验室研究使用，不用于医学诊断

•  抗兔IgG: HRP（组分# 103）的活性受亲核试剂如叠氮化物和羟胺的影响

•  在开始进行样品分析之前，请完整的阅读试剂盒说明书

[试剂盒组分]

 本STK检测试剂盒包含以下组分，足够供96孔样品检测使用：

[产品储存]

•  在4°C条件下，试剂盒中所有试剂组分均可稳定储存至有效期

•  未用完的底物微孔板板条，应重新封装于铝箔袋中（加干燥剂），在4°C可继续储存至有效期

•  剩余的ATP溶液可在-20°C储存6个月或至试剂盒有效期，以较早者为准

[需自备的材料]

• 活性STK：STK必须存储于-70°C。如果需在不同时间多次测定样品，可在解冻后将活性酶样品分装成小管储存于-70°C，此后检测样品前只解冻一次。应避免反复冻融样品，每次冻融都可能导致激酶活性降低

•  去离子水或蒸馏水

•  移液器：能够精确量取1 μL至1000 μL的液体

•  一次性移液器吸头

•  自动洗板机或洗瓶

•  烧杯

•  刻度量筒

•  吸水纸

•  酶标仪：能够测量450 nm处的吸光值

•  黏贴密封纸

[使用建议]

    由于每种STK对底物的反应活性不尽相同（表1），因此在进行酶活性测定之前，建议进行预实验以确定合适的样品稀释度和反应时间，以便后续研究。

•  建立不同酶浓度（包括空白对照）与反应时间的曲线，以确认酶对底物磷酸化的线性反应

• 根据预实验结果选择反应时间和酶浓度，对于抑制剂/激活剂筛选，建议使用给出80% 最大信号值时的酶浓度

[试剂准备]

注意：所有试剂应在使用前新鲜配制

注意：除非另有说明，否则试剂的配制量基于使用完整12×8孔的试验。如果仅使用96孔微孔板的一部分，请按照前述方法储存剩余部分板条（见“产品储存”）

1.  试剂温度

            使用前将以下试剂平衡至室温：

•  微孔板（组分# 101）

•  抗体稀释缓冲液（组分# 104）

•  激酶反应稀释缓冲液（组分# 105）

•  20X洗涤缓冲液（组分# 107）

•  TMB底物（组分# 108）

•  终止液（组分# 109）

2.  活性STK的准备

    注意： STK活性对温度变化敏感，需在冰上解冻和稀释酶样品

a.  活性STK用作阳性对照，用激酶反应稀释缓冲液稀释至最终体积60 μL，置冰上备用

b.  用60 μL激酶反应稀释缓冲液（不含激酶）作为空白对照

3. ATP（组分# 106）

a.  打开盖子之前离心管子，以避免产品损失

b.  用2 mL 激酶反应稀释缓冲液溶解ATP粉末

c.  轻轻颠倒混匀

d.  ATP溶液准备完毕，可用于“测试步骤”（见第8页）

e.  未用完的ATP溶液可在-20℃储存6个月或至试剂盒有效期，以较早者为准

4.  抗兔IgG: HRP（组分# 103）

a.  打开盖子之前离心管子，以避免产品损失

b. 用抗体稀释缓冲液稀释抗兔IgG: HRP至1 μg/ mL（1: 1000），96孔（60μL/孔）需要至少6 mL的工作液，如果仅使用部分微孔板，则仅配制所需的量

c.  轻轻颠倒混匀

d.  抗兔IgG: HRP工作液准备完毕，可用于“测试步骤”（见第8页）

e.  不要重复使用或储存任何剩余的抗兔IgG: HRP工作溶液

5.  洗涤缓冲液

a.  将20X洗涤缓冲液平衡至室温，并轻轻摇匀以溶解储存期间可能形成的晶体沉淀

b. 将30 mL 20X洗涤缓冲液与570 mL去离子水或蒸馏水混合，即为1X洗涤缓冲液，在室温下可稳定放置4周，若需长期储存，则应放置在4°C

[样品准备]

1.  STK样品溶液

注意：本STK检测试剂盒仅适用于含有单一STK的纯化或部分纯化的酶样品测试，对于含有一种以上STK的样品，由于其含有的不同激酶都可能使底物磷酸化，因此不推荐使用本试剂盒。

 部分纯化的酶样品制备

a.  选择合适的色谱柱和缓冲液用于STK纯化

b.  样品上柱，并运行所需的纯化方案

c.  如有必要，用激酶反应稀释缓冲液稀释过柱后分部收集的样品

 注意：建议将分部收集的样品进行梯度稀释（如将样品按1: 2或1: 3梯度稀释，或将10，15，20，30和60 μL样品稀释到60 μL）。

注意：STK纯化没有普遍适用的方法，不同的STK需参考不同的文献。

2.  抑制剂或激活剂筛选

a.  将抑制剂或激活剂稀释到合适的浓度，建议同时使用空白稀释液本身作为阴性对照

b.  在开始酶反应之前，将抑制剂和STK孵育一段时间

注意：反应时间和酶浓度由实验人员通过预实验确定，如第5页的“使用建议”部分所述。酶浓度建议使用给出80% 最大信号值时的浓度。

[测试步骤]

1.  底物微孔板准备

    确定测试需要的底物微孔板孔数，如果需要量少于96个，则从框架中取出多余的板条，并将它们放回到铝箔袋中，加干燥剂后重新封装，储存于4°C。

2.  加样和磷酸化反应

a.  在相应的孔中加入60 μL各样品：

     •  纯化的活性STK（样品准备方法见第6-7页）

•  待测样品（样品准备方法见第6-7页）

•  空白对照（不含激酶的激酶反应稀释缓冲液）

•  阴性对照（空白抑制剂/活化剂缓冲液，用于抑制剂/活化剂筛选研究）

b. 向每个孔中加入10 μL ATP溶液（溶液配制方法见第6页），开始底物磷酸化反应。为避免交叉污染，需更换每个孔的移液器吸头

c.  用黏贴密封纸或塑料盖覆盖微孔板，37℃ 孵育30-60分钟（如能同时轻轻摇动微孔板效果更佳）

注意：反应时间根据预实验确定（见第5页“使用建议”

d.  倒去所有孔中液体，终止磷酸化反应，将孔口朝下轻拍吸水纸以去除残余液体

3.  洗涤

a.  倒去所有孔中液体

b. 使用多通道移液器、自动洗板机或洗瓶，向孔中加300 μL 1X洗涤缓冲液（为了减少背景，可在每次洗涤之间用1X洗涤缓冲液浸泡30-60秒）

c.  倒去所有孔中液体，按同样的方法用1X洗涤缓冲液重复洗涤3次，共洗涤4次

d.  第4次洗涤后，倒去所有孔中液体，将孔口朝下轻拍吸水纸以去除残余液体

4.  加特异性磷酸化底物抗体

a.  在每个孔加入60 μL特异性磷酸化底物抗体

b. 用新的黏贴密封纸（或塑料盖）覆盖微孔板条，室温孵育60分钟（如能同时轻轻摇动微孔板效果更佳）

c.  按步骤3所述方法洗涤微孔板

5.  加抗兔IgG: HRP工作液（新鲜配制，见第6页）

a.  在每个孔中加入60 μL新鲜配制的抗兔IgG: HRP工作液。

b. 用新的黏贴密封纸（或塑料盖）覆盖微孔板条，室温孵育30分钟（如能同时轻轻摇动微孔板效果更佳）

c.  按步骤3所述方法洗涤微孔板

6.  加TMB底物和酸性终止液

a.  在每个孔中加入60 μL TMB底物

b. 室温孵育15-30分钟（孵育时间由实验人员根据颜色强度变化决定）

c.  按TMB底物的加样顺序，向每个孔中加入60 μL终止液

7.  吸光度测定

a.  按产品说明书设置酶标仪

b.  设定波长为450 nm

c.  测量吸光度

[STK活性测定示例]

         图2显示了使用本检测试剂盒测试活性STK纯品的实验结果，该分析试验按“测试步骤”所述进行，酶反应条件为：37℃，30分钟。该试验数据仅为示例，不应用于计算实际的检测结果。

图 2  STK活性测定结果示例

[注意事项]

•  对本分析方法的修改可能会影响该STK检测试剂盒的性能

• 试剂盒中各组分仅在该批号试剂盒产品中保证质量，请不要将其与其他批号试剂盒中的组分混合使用

[参考文献]

1. Robinson-White, A. and Stratakis, C.A. (2002) Ann. N. Y. Acad. Sci. 986: 256-270.
2. Dell’Acqua, M.L. and Scott, J.D. (1997) J. Biol. Chem. 272: 12881-12884.
3. Amieux, P.S., Cummings, D.E., Motamed, K., Brandon, E.P., Wailes, L.A., Le, K., Idzerda, R.L. and McKnight, G.S. (1997) J. Biol. Chem. 272: 3993-3998.
4. Matyakhina, L., Lenherr, S.M. and Stratakis, C.A. (2002) Ann. N. Y. Acad. Sci. 986: 148-157.
5. Lange-Carter, C.A., Fossli, T., Jahnsen, T. and Malkinson, A.M. (1990) J. Biol. Chem. 265: 7814-7818.
6. Cicirelli, M.F., Pelech, S.L. and Krebs, E.G. (1988) J. Biol. Chem. 263: 2009-2019. 

与广谱性蛋白激酶活性检测试剂盒相关产品：