武汉尚恩生物生产的支原体PCR检测试剂盒（巢式PCR）采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支

原体检测的灵敏度和和特异性。基本原理是，先在支原体rRNA上的16S和23S上设
计一对引物，用于扩增部分16S-23S之间的保守区以及全部的其间间隔区，保守区
可以用于判断是否存在支原体污染。

产品名称	支原体PCR检测试剂盒（巢式PCR）
货号	SNCD-001
规格	250次（20ul体系）
简介	支原体（Mycoplasma）别名霉形体，直径0.1-0.3um，具有高度多样性，是一种没有细胞壁、可以用人工培养基培养增殖的最小的原核生物。其广泛存在于人和动物体内，大多数不致病。由于其广泛存在，外加体积较小可以通过滤膜混入细胞培养体系，也很难通过普通光镜观察到，普通抗生素对其也没有有效的抑制作用，因此成为细胞培养中比较常见而且难以检测清除的污染。 支原体污染对细胞会有多方面的影响，包括以下方面：1.细胞生长速度改变；2.细胞形态、状态改变；3.细胞染色体异常、突变甚至功能改变；4.细胞对环境冲击耐受力降低；5.相关细胞实验获得的数据异常等。可以说对细胞及细胞相关实验有极其严重的影响，因此检测及清除广泛存在的支原体污染成为诸多实验室必须要经历的过程。 支原体污染无法通过肉眼或者普通光镜直接判断，只能通过各种试剂、仪器检测。支原体常规检测方法有：荧光法、培养法、电镜法、常规PCR法、一步PCR法、化学发光法等，不同检测方法能够检测的支原体种类不同，其检测灵敏度、特异性、便捷性也有各自的特点。 本公司生产的支原体PCR检测试剂盒采用巢式PCR法(Nested PCR)以提高支原体检测的灵敏度和和特异性。基本原理是，先在支原体rRNA上的16S和23S上设计一对引物，用于扩增部分16S-23S之间的保守区以及全部的其间间隔区，保守区可以用于判断是否存在支原体污染，因此初次PCR产物即可初步判定是否存在支原体污染；其次，在23S和间隔区设计第二对引物，保证第二对引物目标序列在第一对引物目标序列之内，形成巢式结构，然后使用第二对引物对初次PCR的产物进行二次扩增，可以大大提高检测的特异性和灵敏度。原理图如下：
使用方法	1.客户需要自备的试剂、仪器 <1>待检测样品：细胞上清、血清或者培养基、细胞DNA。 细胞上清建议使用培养细胞3-5天的上清，培养时间过短的上清支原体含量较低可能无法有效检出，血清或者培养基也应在培养箱静置培养1-2天使支原体有一定程度增殖再用于检测；细胞悬液无法直接用于检测，需要提取总DNA后检测，添加量为PCR体系的1/20或更少。 <2>仪器、试剂 a.PCR相关：PCR仪、无菌PCR管、微量离心机 b.电泳相关：琼脂糖凝胶、电泳仪、电泳缓冲液、DNA marker、DNA染色液 c.通用：移液器、无菌Tip头、离心管等 2.实验步骤 <1>1st PCR a.按以下表格加入各反应试剂 b.1st PCR反应参数： STEP1 (起始变性): 94ºC 30sec STEP2 (变性): 94ºC 30sec STEP3 (退火): 55ºC 2min STEP4 (延伸): 72ºC 1min STEP5 (循环): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最终延伸): 72ºC 5min STEP7 (临时保存): 4ºC forever <2>2nd PCR a.按以下表格加入各反应试剂 b.2nd PCR反应参数： STEP1 (起始变性): 94ºC 30sec STEP2 (变性): 94ºC 30sec STEP3 (退火): 55ºC 2min STEP4 (延伸): 72ºC 1min STEP5 (循环): Go To STEP2 for 30 cycles STEP6 (最终延伸): 72ºC 5min STEP7 (临时保存): 4ºC forever 3.结果检测 <1>取2次PCR产物各10uL，通过琼脂糖凝胶电泳并染色观察目的条带。由于不同类型的支原体扩增出来的条带大小不一，因此通过条带大小可以粗略判断支原体类型，如需要进一步检测确定，建议对产物进行测序比对。 <2>结果示例 2nd产物    1st 产物    Marker
产品组分
存储条件	-20℃（避免反复冻融）
保质期	-20℃一年（避免反复冻融）

注意事项：
1.该产品-20度可以保存一年以上，但反复冻融或保存不当可能会导致引物或阳性对照失效，如需多次使用，建议小量分装。
2.该试剂盒确认可以检测Mycoplasma arginini 、Mycoplasma arthritidis  等12种支原体，但无法检测人肺炎支原体。
3.该产品仅供科研使用，不得用于诊断或临床实验。