iElisa 磺胺喹噁啉检测试剂盒

iElisa 磺胺喹噁啉检测试剂盒

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1. 概要 磺胺喹嗯啉（sulfaquinoxaline，简称 SQ）在国 内需求量极大的磺胺类高效抗球虫和抗菌药。由于 养殖场在饲养动物过程中向饲料或动物饮用水中 添加，导致其在动物源食品中大量残留。人食用这 些动物源食品后可造成磺胺喹噁啉在人体内富集， 从而使人发生过敏等反应，严重的还会产生致畸、 致癌作用。为此世界各国均制定了相对严格的兽药 残留标准。 2. 原理 测定的基础是抗原-抗体反应。微孔板上包被有 偶联抗原。加入抗体和磺胺喹噁啉标准品或样品， 游离的磺胺喹噁啉与偶联抗原竞争结合抗体，与偶 联抗原结合后的抗体被固定在微孔板上，没有结合 的抗体被洗去，微孔板上的偶联物与经酶标记的二 抗相结合，加入 TMB 底物显蓝色，加入终止液后 颜色由蓝变黄，用酶标仪在 450nm 处检测，吸光值 与样品中磺胺喹噁啉含量成负相关，与标准曲线比 较即可得出磺胺喹噁啉残留物的含量。 3. 试剂盒组成 1) 包被有抗原的96微孔板：1块（96 孔，12 条×8 孔） 2) 磺胺喹噁啉标准品：0 ng/mL、1.0ng/mL、 5.0ng/mL、20.0ng/mL、50.0ng/m、 l00.0ng/mL、200.0ng/mL 1 瓶 × 1.0mL 3) SQ抗体： 1 瓶 × 10mL 4) 酶标二抗： 1 瓶 × 10mL 5) 10× 浓缩洗涤液： 1 瓶 × 50mL 6) 5×复溶液： 1瓶 × 20mL 7) 稀释缓冲液： 1瓶 × 50mL 8) 显色底物： 1 瓶 × 12mL 9) 终止液： 1 瓶 × 7mL 10) 试剂盒说明书 4. 需要的仪器、试剂 1）仪器 —酶标仪 450nm —微量移液器 20μL～200μL，100μL～1000μL —天平：感量 0.01g —离心机 —振荡器 —氮吹仪 —匀质器 2） 试剂 —乙酸乙酯 —正己烷 —蒸馏水 5. 工作溶液的配制 1) 洗涤液的配制：将浓缩洗涤液用去离子水稀释 10 倍后使用（1 份浓缩洗涤液加 9 份蒸馏水）。 2) 复溶液：用去离子水将 5×浓缩复溶液按 5 倍稀 释(1 份浓缩复溶液加 4 份去离子水) 浓缩复溶 液如有沉淀析出，用 50℃左右水浴温热，沉淀 将消失 6. 样品处理 6.1 肉样 1） 称取 3g 匀质肉样，加入 3mL 水、6mL 乙酸乙 酯，振荡 20min，3000 转离心 10min。 2） 取 4mL 上层乙酸乙酯于另一干净离心管中， 60℃氮气吹干。 3） 分别加入 1mL 正己烷、1mL 复溶液，涡旋 30s， 3000 转离心 10min，取下层用样品稀释液 4 倍 （100μL +300μL）稀释，取 50μL 用于检测 稀释倍数：2 6.2 牛奶 1) 取 2g 新鲜牛奶，加入 6mL 乙酸乙酯，振荡 20min，3000 转离心 10min。 2) 取 1.5mL 上层乙酸乙酯于另一干净离心管中， 60℃氮气吹干。 3) 分别加入 1mL 正己烷、1mL 复溶液，涡旋 30s， 离心 3000g，10min，取下层 50μL 用于检测 稀释倍数：2 6.3 蜂蜜 1) 取2g蜂蜜于离心管中，分别加入4mL水和4mL 乙酸乙酯，振荡 20min，3000 转离心 10min。取 2.5mL 底液于一干净试管中吹干，用 1mL 复溶液复容。 2) 取 1.0mL 上层乙酸乙酯于另一干净离心管中， 60℃氮气吹干。 3) 加入 1mL 样品稀释液复容，取 50μL 用于检测 稀释倍数：2 6.4 鸡蛋 1) 称取 2g 匀质鸡蛋样品，加入 12mL 乙酸乙酯， 振荡 20min，3000 转离心 10min。 2) 取 6mL 上层乙酸乙酯，60℃，氮气吹干。 3) 分别加入 1mL 正己烷、1mL 复溶液，涡旋 30s， 3000 转离心 10min，取下层 50μL 用于检测 稀释倍数：1 7． 酶联免疫分析程序 7.1 测定之前注意事项 1) 使用前将所有试剂平衡至室温（20-25℃）。 2) 使用后迅速将试剂放入 2-8℃冷藏。 3) 在 ELISA 分析中的再现性，很大程度上取决于 洗板的*性，正确的洗板操作是 ELISA 测定 程序中的要点。 4) 所有孵育过程应避免阳光直射，并按要求用盖 板覆盖住酶标板。 7.2 测定程序 1) 将足够标准品和样品所用数量的孔条插入酶 标板架，标准品和样品做两个平行实验，记录 下标准和样品的位置。未使用的酶标板用铝箔 袋封好置 2-8℃冷藏保存。 2) 分别吸取50μL 标准品和样品加至相应的微孔 （双孔）中，然后再各加入50μL 的SQ抗体， 装入袋中密封，室温温育30min。 3) 倒出孔中的液体，每孔加入250μL 稀释好的洗 涤液洗涤，重复操作四次。洗板时每次间隔30s， 洗完后用力在吸水纸上排干。 4) 每孔加入酶标二抗100μL，室温避光温育 20min。 5) 重复步骤3，反复洗涤四次。 6) 每孔加入100μL显色底物，室温避光温育 10min。 7) 每孔加入50μL终止液，混匀。 8) 置于酶标仪中，振荡混匀，在450nm处测定吸 光度值（OD值），参比波长630nm。（iElisa全 自动酶标仪可以直接读出、打印浓度值）。 8. 结果计算 1) 所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值 的平均值（B）除以*个标准（0 标准）的吸 光度值（B0）再乘以 100%，即百分吸光度值。 百分吸光度值（%）＝ B ×100% B0 以磺胺喹恶啉标准浓度与所获得的各标准点 和样品的平均百分吸光度值值做 log-logit（B/B0 ） 回归。相对应每一个样品的浓度可以从标准曲线上 读出。 2） 样品的实际浓度为读数结果乘以相应稀释倍 数。 3） 如果测定值超出检测范围，样品提取溶液按一 定的比例用稀释后的复溶液进行稀释。 9. 注意事项 1） 室温低于20℃或试剂及标本未回到室温（20- 25℃）会导致数值偏低。 2） 在洗板过程中如果出现板孔干燥过久的情况， 则会出现标准曲线不成线性，重复性不好的现 象。所以洗板排干后应立即进行下一步操作。 3） 标准物质和显色液对光敏感，避免直接暴露在 光线下。 4） 混合要均匀，洗板要*（包括加样品和标准 液的时候都必需充分混合均匀）。 5） 反应停止液为强酸性物质，避免接触皮肤。 6） 不要使用过了有效期的试剂盒，也不要稀释或 搀杂使用不同生产厂家的试剂盒这样会引起灵 敏度降低。 7） 试剂盒的储存条件是2-8℃，切勿冷冻。 10. 检测方法灵敏度、准确度、精密度 1) 试剂盒灵敏度: 1.0ppb 2) 试剂盒变异系数：小于 20%。 3) 试剂盒准确度：回收率范围在 70％-120％之 间。