1	标准品（100pg/ml）	0.5ml	7	显色剂A液	6ml
2	标准品稀释液	6mL	8	显色剂B液	6ml
3	酶标包被板	12孔×8条	9	终止液	6ml
4	酶标试剂	6ml	10	说明书	1份
5	20×浓缩洗涤液	25ml	11	封板膜	2张
6	样品稀释液	6ml	12	密封袋	1个

注：标准品用标准品稀释液依次稀释为：100、50、25、12.5、6.25、0 pg/ml

需要而未提供的试剂和器材

1. 37℃恒温箱。

2. 标准规格酶标仪。

3. 精密移液器及一次性吸头

4. 蒸馏水，

5. 一次性试管

6. 吸水纸

注意事项

1. 从2-8℃取出的试剂盒，在开启试剂盒之前要室温平衡至少30分钟。酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2. 各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差

3. 建议所有标准品、样本都做双份检测。

4. 严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

5. 为避免交叉污染，要避免重复使用手中的吸头和封板膜。

6. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

7. 底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。

洗板方法

手工洗板方法：甩掉酶标板内的液体；在实验台上铺垫几层吸水纸，酶标板朝下用力拍几次；将稀释后的洗涤液至少0.35ml注入孔内，浸泡1-2分钟。根据需要，重复此过程数次。

自动洗板：如果有自动洗板机，应在熟练使用后再用到正式实验过程中

标本要求

1．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。

2．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

操作程序

1. 分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准品孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品孔中加入标准品50μl；在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品zui终稀释度为5倍）。每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37℃温育60分钟。

2. 弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。

3. 每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

4. 取出酶标板，每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

5. 测定：以空白孔调零，在450nm波长下测量各孔的吸光度值（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

6. 根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。也可以使用各种应用软件来计算。应记住由于样品稀释了的，其实际浓度应该乘以总稀释倍数。

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