实验原理

Trizol主要物质是异硫氰酸胍，它可以破坏细胞使RNA释放出来的同时，保护RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的的水样层后，RNA 可以通过异丙醇沉淀来还原。无论是人、动物、植物还是细菌组织，Trizol法对少量的组织(50-100 mg)和细胞(5×10⁶)以及大量的组织(≧1 g)和细胞(>107)均有较好的分离效果。Trizol试剂操作上的简单性允许同时处理多个的样品。所有的操作可以在一小时内完成。Trizol抽提的总RNA能够避免DNA和蛋白的污染。故而能够作RNA 印迹分析、斑点杂交、poly(A) 选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。

实验试剂

Trizol 溶液

氯仿

异丙醇

75%乙醇

DEPC

实验设备

超净工作台

1.5 mL离心管

移液枪

紫外分光光度计

石英比色皿

泳槽和模具

电泳仪

凝胶成像系统

实验材料

大肠杆菌

实验步骤

1. 采用 Trizol 溶液提取细菌的总 RNA

    (1)挑取工程菌单菌落，培养至稳定期，取菌液 3 mL 离心得菌体于1.5 mL离心管；

    (2)每管加入 1 mL Trizol 溶液，盖紧管盖，激烈振荡15 s，室温静置5 min；

    (3)4℃，12000 g，离心 10 min；

    (4)取上清转入（约 1 mL）新的 1.5 m L离心管中；

    (5)每管加入 0.2 mL 的氯仿（0.2 体积 Trizol），盖紧盖，剧烈振荡 15 s；

    (6)室温静置 3 min；

    (7)4℃, 12000 g, 离心 10 min；

    (8)小心吸取上层水相，转入另一新的 1.5 mL 离心管，测量其体积；

    (9)加入1倍体积的氯仿，盖紧盖，剧烈振荡 15 s；

    (10)室温静置 3 min；

    (11)4℃，12000 g，离心 10 min；

    (12)小心吸取上层水相，转入另一已编号新的 1.5 mL 离心管；

    (13)加入 0.5 mL 的异丙醇（0.5 体积 Trizol），轻轻颠倒混匀；

    (14)室温，静置 10 min；

    (15)4℃，12000 g，离心 10 min，RNA 沉于管底；

    (16)小心吸去上清，加1 mL75%的乙醇（预冷），并轻柔颠倒，洗涤沉淀；

    (17)4℃，7500 g，离心 5 min；

    (18)小心弃上清，微离，吸去剩余乙醇，室温干躁 10 min；

    (19)各管用 50 μL DEPC 处理过的双蒸去离子水溶解，55-60℃温育5 min，分装，-80℃贮存（可贮存5周）；

2. RNA 浓度的测定

取 10 µL RNA 样品以双蒸水稀释至 2 mL，转入预先以无水乙醇隔夜浸泡后晾干的石英比色皿中，小心排除气泡，以等体积的双蒸水作为空白对照，在紫外分光光度计中分别测定 260 nm、280 nm、360 nm（参比波长）的光吸收值，根据公式计算 RNA 的浓度。

RNA 浓度（µg/µL）= OD₂₆₀ × 稀释倍数（200）× 40（µg/mL）/1000

纯 RNA 样品的 OD₂₆₀/OD₂₈₀ 比值为 1.8~2.0，若低于该值，表明存在蛋白质污染，可重新用酚∕氯仿抽提。该值为 2.0 时，RNA 纯度为zui高。

3. RNA 质量检测

将 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳检测，目的在于检测 28 S 和 18 S 条带的完整性和它们的比值，或者是 mRNA smear 的完整性。一般认为，如果 28 S和18 S 条带明亮、边缘清晰，并且18 S的亮度在 18 S 条带的两倍以上，则 RNA的质量较好。

    (1)将洗净、干燥的电泳槽和模具，水平放置在工作台上;

    (2)准确称取 0.15 g琼脂糖加入 15 mL 1 × TAE 中，摇匀，在微波炉内将琼脂糖溶液以zui短时间*溶解（中火档 2 min），待冷却至60℃时，加入 GoldView（终浓度为 5 µL/mL），充分混匀;

    (3)插入适当的梳子，将温热的凝胶倒入胶模中，凝胶厚度为 3~5 mm，置于室温下凝固（约 30 min）;

    (4)待凝胶凝固后，小心移去梳子，将凝胶置于电泳槽中，加入电泳缓冲液，使液面高出凝胶 1~2 mm;

    (5)用微量移液器将样品与上样缓冲液混合并将混合液小心加入上样孔内，同时加入合适分子量范围的 DNA 分子量标准作为对照;

    (6)盖上电泳槽盖，调节电压 100 V，电泳 40 min 左右;

    (7)电泳完毕后将凝胶置于紫外透射检测仪上观察结果，用凝胶成像系统照相保存。

注意事项

1. 提取时要做到超净台内操作、操作带一次性手套、EP管及Tip头都要用0.1%处理（0.1% DEPC浸泡过后，高压蒸气灭菌）、小心、细致、晃动及每次移液要轻。这样做的*目的就是两个，一是小心RNAse的污染降解RNA；二是动作过度暴力破坏RNA的完整性。

2. 一般RNA电泳应该是做甲醛变性电泳，但是一般的琼脂糖电泳也可以，需要上样量稍微大些，并且跑电泳的时间越短越好（这样也是为了减少外界RNAse对RNA的降解），跑完电泳立刻观察。