人结肠癌氟尿嘧啶耐药株

1.试剂和溶液

乙醇: 无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇

抗原修复液: 0.01M的柠檬酸钠缓冲液：58.82g柠檬酸三钠及7.56g柠檬酸溶于200ml纯水，调pH至 6.0，纯水1:100稀释为工作液

3%过氧化氢-甲醇: 30%的过氧化氢与无水甲醇1:9稀释

10X PBS: 80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和2.4g KH2PO4 加1 L纯水，调pH至 7.4

洗涤液: 1×PBS：纯水稀释10× PBS；1× PBST：含0.05% Tween-20 的1×PBS（1×PBST）super block，生物素标记的UltraTekAnti-Polyvalent二抗，酶标亲和素UltraTek HRP，DAB

显色试剂盒：Cat. KT1002a

抗体稀释液：3%BSA-PBS

0.5%盐酸-乙醇：0.5～1%盐酸，95.0～95.5%乙醇

苏木素：苏木精2g溶于250ml无水乙醇，十六水合硫酸铝17.6g 溶与750ml纯水，以上溶液充分混合，加入碘酸钠 0.2g和冰醋酸20ml

2.实验步骤

1组织固定：烘箱温度65-75℃ 30min或者65℃隔夜；

2脱蜡：二甲苯浸泡三次，每次10分钟；

3水化：依次经过无水乙醇，95%乙醇，85%乙醇，70%乙醇浸泡，每次5min；

4洗涤：自来水冲洗1次，PBS浸泡3min；

5抗原修复：放入稀释100倍的柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0) 中，高压锅煮沸10min，常温冷却30min；

6洗涤：纯水浸泡2次，PBS浸泡1次，每次3min；

7灭活酶：室温下3%过氧化氢-甲醇暗处处理切片15min；

8洗涤：纯水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；

9封闭：加入适当体积的super block（KT1002a Reagent A），37℃温箱孵育5min；

10洗涤：纯水浸泡1次，PBS浸泡2次，每次3min；

11一抗：加入反应体积为0.15ml，适合浓度的一抗, 37℃ 湿盒孵育60min。

12洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

13加入适当体积生物素标记的UltraTek Anti-Polyvalent的二抗（KT1002a Reagent B），37℃湿盒孵育10min；

14洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

15加入适当体积酶标亲和素UltraTek HRP（KT1002a Reagent C）, 37℃湿盒孵育10min；

16洗涤：PBST浸泡3次，PBS浸泡1次，每次3min；

17显色：滴加适量DAB显色液(KT1003a)至切片上，室温显色1~5min，自来水冲洗；

18复染：苏木素染色5min，蒸馏水冲洗5min；

19分化： 0.5%盐酸乙醇混合液中分化，自来水冲洗3-4次， PBS中浸泡10-20秒返蓝，自来水冲洗2次。

20脱水：经过70%乙醇，85%乙醇，95%乙醇，无水乙醇浸泡，每次5min；

21透明：二甲苯浸泡2次，每次10-15min；

22封片：晾干后加中性树胶，盖玻片封片；

23结果：显微镜观察，记录结果。

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