免疫组化染色方法大汇总
免疫组化的方法很多，新方法层出不穷，如二步法，要不断更新，与时俱进。虽然这些方法各有其特色，但总的来说，只要应用恰当均可获得较为满意的结果。方法 的选择并不是影响免疫组化结果的主要因素。问题在于一个单位应常规地、固定地使用一种方法，不宜交替使用不同的方法或经常更换方法。一旦选定一种方法，应 务必使其标准化，力图使一抗、二抗、标记试剂和底物的浓度、孵育时间和浓度、缓冲液的使用程序化、规范化。

一、SP法免疫组化染色
原理
链霉素抗生物素蛋白（SA）是从链霉素中分离出的蛋白质，穿透组织的能力比ABC、PAP复合物大，反应速度快，它含有四个亚基，每个亚基都有与生物素 （Biotin）连接的部位，且二者间有*的亲和力，SA的等电位接近于6.5，近中性，而卵白素（Avidin）为10，因此，SA几乎不与组织中的 内源性凝集样物质发生非特异性结合，使用链霉素抗生物素蛋白－过氧化物酶放大系统，即可产生低背景、高放大效果。S－P采用生物素标记的第二抗体与链霉素 抗生物素蛋白连接的过氧化物酶及基质素混合液来测定细胞和组织中的抗原。
基本染色方法
1、石蜡切片脱蜡至水；
2、3％H202室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性；
3、蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，（如需采用抗原修复，可在此步后进行）；
4、5～10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1～2小时或4℃；
5、PBS冲洗，5分钟×3次；
6、滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1％BSA－PBS稀释），37℃孵育10～30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10～30分钟；
7、PBS冲洗，5分钟×3次；
8、滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10～30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10～30分钟；
9、PBS冲洗，5分钟×3次；
10、显色剂显色（DAB或AEC）；
11、自来水充分冲洗，复染，封片。
附：冰冻切片免疫组化染色步骤
1、冰冻切片4～8um，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3次。
2、用3％过氧化氢孵育5～10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。
3、PBS洗，5分钟×2次。
4、下接石蜡切片免疫组化染色操作步骤。

二、卵白素－生物素－过氧化物酶复合物法
原理
本方法是利用卵白素与生物素*的高度亲和力这一生物学特性，先将生物素与酶结合，形成生物素化HRP，以生物素化HRP与卵白素按一定比例混合，形成一 个复合物。具体步骤是：特异性抗体与组织中抗原结合形成抗原抗体复合物。生物素化二抗再与特异性抗体反应，然后加入ABC复合物，形成抗原＋特异性抗体＋ 生物素化二抗＋卵白素＋生物素＋HRP复合物。zui后DAB显色。
基本染色方法
1、切片常规脱蜡至水；
2、PBS洗5分钟×2次；
3、0.3％甲醇－H2O2 30分钟，37℃；
4、PBS洗5分钟×2次；
5、正常动物血清20分钟，37℃；
6、适当稀释的特异性抗体60分钟，37℃；
7、PBS洗5分钟×2次；
8、适当稀释的生物素标记二抗，30分钟，37℃；
9、PBS洗5分钟×2次；
10、ABC复合物30－60分钟，37℃；
11、PBS洗5分钟×2次；
12、DAB显色，镜下控制；
13、苏木素衬染、脱水、透明、中性树胶封固。
附：微波－ABC法具体操作
1、常规脱蜡：二甲苯I、II各10分钟，*I、II各10分钟；
2、将切片置入装有PBS液的染色缸中，微波修复1分钟，冷却置室温；
3、滴加*抗体，微波修复1分钟，孵育20分钟，PBS液冲洗3缸×3分钟；
4、滴加第二抗体，微波修复1分钟，孵育10分钟，PBS液冲洗3缸×3分钟；
5、滴加第三抗体，微波修复1分钟，孵育10分钟，PBS液冲洗3缸×3分钟；
6、DAB显色，（显微镜下控制）终止显色，蒸馏水水冲洗。
7、苏木素衬染，盐酸酒精分化，水洗，封片。

三、直接法
原理
用酶标记的特异性抗体直接与标本中的相应抗原反应结合，再与酶的底物作用产生有色的产物，沉积在抗原－抗体反应的部位。
优点：简单、步骤少、省时、特异性强、非特异染色较轻；
缺点：敏感性差。
基本染色方法
1、切片常规脱蜡至水，PBS液，洗5分钟；
2、1：20稀释的正常血清处理切片20分钟；
3、滴加适当稀释酶标抗体，放在湿盒中，37℃，30～60分钟；
4、PBS洗5分钟×2次；
5、显色，镜下控制；
6、苏木素衬染、脱水、透明、中性树脂封固。

四、间接法
原理
先用未标记的特异性抗体（一抗）与标本中的相应抗原反应，再用抗特异性抗体的酶标记抗体与结合在抗原上的一抗反应。
优点：方法简便、敏感性较直接法高；
缺点：非特异染色较多。
基本染色方法
1、与直接法（1）～（2）相同；
2、滴加适当稀释的特异性抗体，4℃到第二天，或室温30～60分钟；
3、PBS洗5分钟×2次；
4、滴加酶标记抗体，室温30分钟；
5、后同直接法。

五、酶桥法
原理
用化学交联法将酶与抗体分子连接，染色时在特异性抗体与标本中抗原结合之后，用桥抗体结合于其上，再将抗酶抗体结合于桥抗体上，zui后把酶结合在酶抗体上，经过底物的呈色反应而将抗原显示出来。
优点：提高了方法的敏感性，非特异染色较轻；
缺点：抗酶抗体必须是价、经过高度纯化，否则将降低敏感性。
基本染色方法
1、组织切片脱蜡至水，PBS洗5分钟×2次；
2、用.。3％H2O2－甲醇在室温中处理切片5～30分钟；
3、充分水洗后，PBS洗5分钟×2次；
4、1：20稀释正常血清，室温30分钟；
5、PBS洗5分钟×2次；
6、一抗，4℃，16～24小时；
7、PBS洗5分钟×2次；
8、二抗，室温30分钟，PBS洗5分钟×2次；
9、滴加抗酶抗体，室温30分钟，PBS洗5分钟×2次；
10、用过氧化物酶溶液作用30分钟，PBS充分洗净；
11、在DAB－H2O2液中进行显色5～30分钟，镜下控制；
12、下同直接法。

六、过氧化物酶－过氧化物酶复合物法（PAP法）
原理
PAP法的基本原理与酶桥法相同，只是用酶和抗体制成的免疫复合物（PAP）代替了酶桥法中的抗酶抗体和随后结合的酶，把两个步骤合并为一个步骤。
优点：敏感性比间接法高20倍；
缺点：理论上PAP是一种复合物，因其不是抗HRP抗体，不能与HRP结合，不会造成背景染色，但在实际工作中仍存在比较重的非特异性背景染色。
基本染色方法
1、组织切片脱蜡至水；
2、用0.3％H2O2－甲醇在室温中处理切片5～30分钟；
3、充分水洗后，PBS洗5分钟×2次；
4、1：20稀释正常血清，室温30分钟；
5、滴加一抗（兔），4℃中反应13～24小时；
6、PBS洗5分钟×2次；
7、加羊抗兔IgG，室温30分钟，PBS洗5分钟×2次；
8、加PAP，室温30分钟，PBS洗5分钟×2次；
9、用DAB显色5～30分钟；
10、苏木素衬染、脱水、透明、中性树胶封固。