微生物菌种的保藏

目的
1、了解各种保藏方法的优缺点及其适用的目标微生物。
2、学习并掌握几种常用的微生物菌种保藏方法。
原理
保藏微生物菌种的目的不仅要保存菌株的生命本身，而且还必须要尽可能地使菌株的遗传性状保持不变，同时保证其在整个保存过程中不被他种微生物污染。因此，选择一种能够长期有效且稳定的保藏微生物菌种的方法事关重要。

人主动脉平滑肌细胞HA-VSMC细胞
人肺动脉平滑肌细胞HPASMC/STC-1细胞
人脐静脉内皮细胞HUV-EC-C细胞
肾小管内皮细胞HK2细胞
骨肉瘤细胞U-2OS细胞
MDA-MB-231细胞
小鼠睾丸间质细胞TM3/4细胞
由于微生物种类繁多，且保存方法的难易程度不同，所以微生物菌种的保藏方法亦有许多。但是不管有多少种菌种保藏方法，其基本原理都要求使微生物的代谢作用降至zui低程度，从而使其处于不活泼的状态，即休眠状态。就微生物本身而言，保藏就是要利用它们处于休眠状态的孢子或芽孢而进行；而从环境条件来说，就是要选用低温、干燥和缺氧等三个条件。以下将对几种微生物菌种的保藏方法加以简单介绍。
1、传代保存法：有些微生物当遇到冷冻或干燥等处理时，会很快死亡，因此在这种情况下，只能求助于传代培养保存法。传代培养就是要定期地进行菌种转接、培养后再保存，它是zui基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生产菌种的保存。
传代保存时，培养基的浓度不宜过高，营养成分不宜过于丰富，尤其是碳水化合物的浓度应在可能的范围内尽量降低。培养温度通常以稍低于zui适生长温度为好。若为产酸菌种，则应在培养基中添加少量碳酸钙。
一般地，大多数菌种的保藏温度以5℃为好，像厌氧菌、霍乱弧菌及部分病原真菌等微生物菌种则可以使用37℃进行保存，而蕈类等大型食用菌的菌种则可以室温直接保存。
传代培养保存法虽然简便，但其缺点也很明显，如：①菌种管棉塞经常容易发霉；②菌株的遗传性状容易发生变异；③反复传代时，菌株的病原性、形成生理活性物质的能力以及形成孢子的能力等均有降低；④需要定期转种，工作量大；⑤杂菌的污染机会较多。
2、液体石蜡覆盖保存法：该法较前一种方法保存菌种的时间更长，适用于霉菌、酵母菌、放线菌及需氧细菌等的保存。此法可防止干燥，并通过限制氧的供给而达到削弱微生物代谢作用的目的。其具有方法简便的优点，同时也适用于不宜冷冻干燥的微生物（如产孢能力低的丝状菌）的保存，而某些细菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、红螺菌及沙门氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克银汉霉、毛霉、根霉等不宜采用此法进行保存。
3、载体保存法：即将微生物吸附在适当载体上进行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下几种，如
① 土壤保存法：主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌种的保藏。方法是在灭菌的土壤中加入菌液，立即在室温下进行干燥或使菌体繁殖后再干燥，然后冷藏或在室温下密封保存。保存用的土壤原则上以肥沃的耕土为宜，土壤需风干、粉碎、过筛和灭菌。
使微生物在土壤中繁殖后进行干燥保存的方法是：取适量土壤（5克）置于塞有棉塞的试管中，加水或加入充分稀释的液体培养基（以含水量为土壤zui大持水量的60%为宜），然后高压灭菌。再将需保存的微生物进行大量接种，培养至菌丝能用肉眼确认的程度为止，移入干燥器中经短时间干燥或风干后密封，冷藏或室温保存。
② 砂土保存法：取清洁的砂，过60目筛去掉大砂粒，并用磁铁吸去砂中铁屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗数次，干燥后，置于试管或安瓶管中保持2～3cm深，再经干热灭菌后，加入1ml菌种培养液，经充分混匀后，放入真空干燥器中，*干燥后熔封保存。也可用二份洗净的砂（经HCl预处理）和一份贫瘠、过筛的黄土搀和后灭菌，再进行菌种保藏。
③ 硅胶保存法：以6～16目的无色硅胶代替砂子，干热灭菌后，加入菌液。加菌液时，由于硅胶的吸附热常使温度升高，因而需设法加以冷却。
④ 磁珠保存法：将菌液浸入素烧磁珠（或多孔玻璃珠）后再进行干燥保存的一种方法。在螺旋口试管中装入1/2管高的硅胶（或无水CaSO4），上铺玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，经干热灭菌后，接入菌悬液，zui后冷藏、室温保藏或减压干燥后密封保藏。本法对酵母菌很有效，特别适用于根瘤菌，可保存长达两年半时间。
⑤ 麸皮保存法：在麸皮内加入60%的水，经灭菌后接种培养，zui后干燥保藏。
⑥ 纸片（滤纸）保存法：将灭菌纸片浸入培养液或菌悬液中，常压或减压干燥后，置于装有干燥剂的容器内进行保存。
4、悬液保存法：即使微生物混悬于适当溶液中进行保存的方法。常用的有，
① 蒸馏水保存法：适用于霉菌、酵母菌及绝大部分放线菌，将其菌体悬浮于蒸馏水中即可在室温下保存数年。本法应注意避免水分的蒸发。
② 糖液保存法：适用于酵母菌，如将其菌体悬浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗处保存，可长达10年。除此之外，也可使用缓冲液或食盐水等进行保存。
5、寄主保存法：即令微生物侵入其寄主后加以保存的方法。
6、冷冻保存法：适用于抗冻力强的微生物。这些微生物可在其菌体细胞外遭受冻结的情况下而不受损伤，而对其它大多数微生物而言，无论在细胞外冻结还是在细胞内冻结，都会对菌体造成损伤，因此当采用这种保藏方法时，应注意以下几点，
① 要选择适于冷冻干燥的菌龄细胞；
② 要选择适宜的培养基，因为某些微生物对冷冻的抵抗力，常随培养基成分的变化而显示出巨大差异；
③ 要选择合适的菌液浓度，通常菌液浓度越高，生存率越高，保存期也越长；
④ 在菌液内不添加电解质（如食盐等）；
⑤ 可在菌液内添加甘油等保护剂，以防止在冷冻过程中出现菌体大量死亡的现象。同样，也可添加各种糖类、去纤维血液和脱脂牛乳等具有良好保护效果的溶剂，但对有些微生物而言，不加保护剂时更有效。
⑥ 原则上应尽快进行冷冻处理，但当加入保护剂时，可静置一段时间后再进行处理。
⑦ 就动物细胞而言，应在－20℃范围内以1℃/min左右的速度缓慢降温，此后必须尽快降到贮藏温度；而对绝大多数微生物而言，则不必如此，如结构较为复杂的原虫则可在－35℃范围内进行缓慢降温，而噬菌体则必需采用上述的二阶段法进行冷冻；
⑧ 若进行长期保存，则贮藏温度越低越好；
⑨ 取用冷冻保存的菌种时，应采取速融措施，即在35～40℃温水中轻轻振荡使之迅速融解。而就厌氧菌来说，则应选择静置融化的措施。当冷冻菌融化后，应尽量避免再次冷冻，否则菌体的存活率将显著下降。