总抗氧能力（T-AOC）测定试剂盒

适用范围

   本试剂盒适用于检测动物血清、组织、植物提取等中的总抗氧化能力测定。

一、测定意义

机体防御体系的抗氧化能力的强弱与健康程度存在着密切，该防御体系有酶促与非酶促两个体系，许多酶是以微量元素为活性中心，例如：超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽S-转移酶（GST）等，非酶促反应体系中主要为维生素、氨基酸和金属蛋白质。例如：VE、胡萝卜素、VC、半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、组胺酸、葡萄糖、铜兰蛋白、转铁蛋白、乳铁蛋白等。这个体系的防护氧化作用主要通过三条途径：（1）消除自由基和活性氧以免引发脂质过氧化；（2）分解过氧化物，阻断过氧化链；（3）除去起催化作用的金属离子。防御体系各成分之间相互起到了协同作用，以及代偿作用与依赖作用。

二、测定原理：

机体中有许多抗氧化物质，能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过比色可测出其抗氧化能力的高低。

三、所需仪器设备

721或722分光光度计、水浴箱

四、试剂盒组成与配制：（100T/50样）

1.试剂一：液体60ml×2瓶，4℃保存。

2.试剂二：粉剂×2支，用时每支加双蒸水至120ml，室温保存。

3.试剂三：黄色储备液10ml×1瓶，避光冷藏保存。储备液的稀释液60ml×1瓶。

试剂三应用液的配制：临用前取储备液以稀释液稀释，比例为1:19.需多少配多少。

4试剂四:溶液24ml×1瓶，室温保存。

5.试剂五：溶液24ml×1瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可使用）。

五、试剂盒组成与配制：（50T/25样）

1.试剂一：液体60ml×1瓶，4℃保存。

2.试剂二：粉剂×1支，用时每支加双蒸水至120ml，室温保存。

3.试剂三：黄色储备液5ml×1瓶，避光冷藏保存。储备液的稀释液30ml×1瓶。

试剂三应用液的配制：临用前取储备液以稀释液稀释，比例为1:19.需多少配多少。

4试剂四:溶液12ml×1瓶，室温保存。

5.试剂五：溶液12ml×1瓶，室温保存（天冷时会凝固，每次测试前适当加温以加速溶解，直至透明方可使用）。

六、操作

（一）   血清（浆）中抗氧化能力测定（样本前处理见附录中的*点）

1.  操作表：

漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟

漩涡混匀器充分混匀，放置10分钟，蒸馏水调零，1cm光径，520nm处测各管吸光度。

*参考取样量：血清(浆)为0.1ml。

2.计算公式

总抗氧能力（单位/毫升血清）=（测定管OD值-对照管OD值）/0.01÷30×（反应液总体积ml/取样量ml）×样品测试前稀释倍数

（二）   组织中总抗氧能力的测定（样本前处理见附录中的第二点）

1.  操作表

漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟

漩涡混匀器充分混匀，放置10分钟，蒸馏水调零，1cm光径，520nm处测各管吸光度。

*组织匀浆参考取样量：为0.1-0.2ml。

2.计算公式

总抗氧能力（单位/毫克蛋白）=（测定管OD值-对照管OD值）/0.01÷30×（反应液总体积ml/取样量ml）×样品测试前稀释倍数÷所测样本的蛋白含量

（三）   全血中总抗氧能力的测定：（样本前处理见附录中的第五点

1.  操作步骤:

漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟

漩涡混匀器充分混匀，放置10分钟，蒸馏水调零，1cm光径，520nm处测各管吸光度。

*参考取样量：全血一般用双蒸水1：9稀释取0.05ml。

2.计算公式：

总抗氧能力（单位/毫升全血）=（测定管OD值-对照管OD值）/0.01÷30×（反应液总体积ml/取样量ml）×样品测试前稀释倍数

七、简便操作（如果您的样本很多可以采用简便操作法）

1.     混合剂的配制：测试前，将试剂一、二、三每种试剂所用量乘以样本数（n）再乘以2（因每只测定管均需做对照管），然后再加上放宽的4只，即n×2+4,混合试剂的具体配制见下：

试剂名称          试剂一              试剂二           试剂三

试剂用量ml     （n×2+4）×1        （n×2+4）×2   （n×2+4）×0.5

将上面所有试剂按顺序加在一起混匀制成混合试剂。混合试剂需现用现配。

2.     血清（浆）、全血简便操作表：

漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟。

漩涡混匀器充分混匀，放置10分钟，双蒸水调零，1cm光径，520nm处，测各管吸光度。

3.     组织样本简便操作：

漩涡混匀器充分混匀，37℃水浴30分钟

漩涡混匀器充分混匀，放置10分钟，双蒸水调零，1cm光径，520nm处，测各管吸光度。

八、注意点

1.     样品保存时间：4-8℃保存5-7天，如果暂时不测，超过5天以上可将样本放在-20℃以下保存，温度越低保存时间越长。

2.     垂直加样及加试剂，不要加到管壁上。

3.     可以先加样品后加1号试剂，但混匀要充分。

4.     若为微量样品，如耳膜组织、牙髓等进行测试时，试管一定要用肥皂水煮开刷洗干净。

5.     做总抗氧化能力、总氨基酸、维生素C、维生素E的试管应与其他品种例如SOD、GSH-PX、ATPase等测试的试管分开，否则会影响酶类的活力。

6.     测定总抗氧化能力、总氨基酸、维生素C、维生素E等的试管清洗时注意：要用热水加洗涤净煮开后，剩热清洗并用自来水冲十余次，单蒸水冲一遍，烤干或晾干。否则会影响其它酶类的测试结果。

7.     在检测过程中，37℃水浴30分钟，在管子中会出现沉淀，加完试剂四后这沉淀会消失，并且不会影响检测结果。

8.     在混匀时，用漩涡混匀器，使液体上下充分混匀（一定使zui下面液体也能旋转到上面）。

9.     试剂四难吸难打，注意：在吸取试剂四及加试剂四时要慢慢吸打。

10.  本试剂盒仅用于科研。

T-AOC测定附录

样本前处理

1.     血浆样本前处理：

血浆在测试前3500转/分离心10分钟，取上清待测，否则有 些抗凝剂会引起沉淀及混浊，肝素抗凝的血浆不要离心，血清不需要离心。

2.     组织样本的前处理:

组织匀浆的制备：准确称取组织重量，按重量体积比加9倍生理盐水制成10%的匀浆，2000-2500转/分离心10分钟，取上清待测。同时用双缩脲试剂测定10%组织匀浆蛋白。

3.     培养细胞的前处理:

培养细胞悬液的制备：

将培养细胞消化，离心，弃上清，留下层细胞，用生理盐水或匀浆介质制备成107/cm3的悬液，即107/ml的悬液，再进行破碎。破碎细胞的方法有三种;1.用云将器匀浆。（可以用匀浆机，也可以用玻璃匀浆器手工匀浆）。2.用进口的超声粉碎器粉碎。3.反复冻融3次。（第3种方法有时会影响酶活力。）制备号的细胞悬液不需要离心，在测试家样前要摇匀后取样。同时用考马斯亮兰试剂测定组织蛋白。

4.     培养细胞的上清及部分体液均可以按照血清样本处理，一般直接加样。

5.     全血样本前处理，一般用双蒸水10倍稀释，具体稀释倍数及取样量要做预试。