应用半制备液相色谱分离制备高纯度苜蓿素

竹茹Bambusae Caulisin Taenias作为药食两用的药材，在《中药辞海》中记载为禾本科刚竹属、箣竹属和牡竹属中一些竹种的茎秆所刮下的外皮层或其次一层，具有清热化痰、除烦止呕等功效，常用于治疗热痰引起的痰热咳嗽、痰火挟痰、烦热呕吐等病症，在《神农本草经》中列为中品，《药品化义》曰：“竹茹轻可去实，凉能去热，苦能降下，专清痰，为宁神开郁佳品”，是临床*的常用药，收载于《中国药典》2010年版。

苜蓿素（tricin），又称麦黄酮、小麦黄素，化学名称为5, 7, 4′-三羟基-3′, 5′-二甲氧基黄酮。苜蓿素在苜蓿[3]、大麦[4]、竹叶[5]、地胆草[6]、软蒺藜[7]、野菊花[8]等植物中多有检出。Hudson等[9]的研究表明苜蓿素能有效抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-468和人结肠癌细胞SW480的生长。Cai等[10]进一步研究了苜蓿素对MDA-MB-468细胞株的体外生长抑制及其细胞周期抑制作用。然而，除了癌症防护之外，已知关于苜蓿素药理活性研究的报道不多，部分原因在于获得苜蓿素单体较困难。目前，苜蓿素单体主要来源于化学合成，从天然植物中分离制备较大量的苜蓿素的相关报道很少，市场上更无苜蓿素对照品出售。本实验采用常规色谱和半制备液相色谱结合的方法制备苜蓿素对照品。该法简便易行，所制备的对照品质量分数可达98%以上。

2  方法与结果

2.1  原料处理竹茹5.5 kg，粉碎至10～20目，采用50%乙醇热回流提取1.5 h，提取两次，合并提取液，减压浓缩成膏状，得膏状物145 g，取50 g上40～60目已处理完毕的聚酰胺树脂，依次采用3倍柱体积10%、30%、50%、70%、95%乙醇洗脱，分别收集样品、浓缩和冻干，经液相色谱检测发现70%乙醇洗脱物制备苜蓿素对照品。

2.2  色谱条件

2.2.1  分析色谱条件

色谱柱为Luna C18ODS（250 mm×4.6 mm，5 µm），流动相为乙腈（A）-1%乙酸水溶液（B），梯度洗脱条件：0～15 min，15% A；15～25 min，15%～40% A；25～34 min，40% A；34～40 min，40%～15% A；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL；柱温40 ℃；检测波长345 nm。

2.2.2  半制备色谱条件 

色谱柱为Luna C18ODS（250 mm×10 mm，10 µm），流动相为乙腈-1%甲酸水溶液（35∶65）；体积流量4 mL/min；进样量1 mL；检测波长345 nm。2.3  苜蓿素对照品的制备将70%乙醇洗脱物溶解于甲醇中，制成10 mg/mL的样品，经滤膜（0.45 µm）滤过后备用，半制备型HPLC分离制备，收集保留时间为18.5～19.5 min的组分（图1），将其减压浓缩干燥（60 ℃以下），zui后冷冻干燥得到淡黄色粉末170 mg，经峰面积归一法计算，制备所得的对照品质量分数为98.1%，竹茹中含苜蓿素69.60 μg/g，得率约为44.10%，苜蓿素对照品的HPLC图谱见图2。

1. 讨论

在进行液相半制备色谱制备前，先将提取物通过聚酰胺柱色谱预处理，在采用10%、30%、50%乙醇洗脱以后，去除了提取物中大量的杂质和一些极性较大的黄酮和酚酸类化合物，使极性较低的苜蓿素得到了进一步的富集。分析色谱发现苜蓿素在30 min左右出峰，乙腈体积分数在40%，为 了尽量减少目标峰与前后杂质峰重叠的可能性，并兼顾单次实验时间和试剂使用量，因此采用了35%乙腈等度洗脱，既能达到目标峰与杂质峰的极限分离，又能尽可能地节约时间和试剂。选用甲醇-水系统，苜蓿素保留时间过长，且分离效果不佳；选用乙腈-水系统，有主峰与杂质峰重叠现象出现，并伴有拖尾现象发生，因此选用乙腈-酸水系统。前期实验发现，使用乙酸时，苜蓿素有较好的分离效果，甲酸稍差，因此在分析测试时采用乙腈-1%乙酸水溶液作为流动相；但乙酸沸点较高，不易蒸发，会引起产品纯度降低，因此在制备过程中选用乙腈-1%甲酸水溶液作为流动相，甲酸沸点与水相近，易与水一起蒸出，不会引起产品纯度降低。单纯的柱色谱分离得到的粗品含有多种微量杂质，纯度达不到对照品的要求。而通过其他方法纯化比较繁琐，通过液相半制备色谱多个紫外波长的检测，方法操作方便，可使苜蓿素峰和杂质峰分开，进而使得对照品质量分数达到98%以上。张锐等[15]结合硅胶柱色谱和制备HPLC法对竹根醋酸乙酯部位进行分离纯化，得到了质量分数大于98%苜蓿素对照品，方法相对简便，制备成本较低，*的不足就是硅胶柱色谱洗脱时，需要使用较大量的有机洗脱试剂。而本实验建立的制备苜蓿素对照品的方法，采用聚酰胺树脂吸附解析，不同体积分数的乙醇作为洗脱试剂，不仅操作方便，重现性好，而且制备的产品纯度高，可用于分析用的对照品，而且避免了有机试剂的大量使用。