G418筛选稳定表达细胞系

1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。

2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。

3.制备筛选培养基：在100ug/ml~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。

4.加G418筛选：吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。

5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。方法同4.

6.确定*筛选浓度：在筛选10~14天内能够杀死所有细胞的zui小G418浓度即为*筛选浓度。在*轮就筛选出*G418浓度的可能性不大，zui有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的 G418的量在10天前就看不到活细胞了。假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug /ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定*筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的*用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml，这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、 300ug/ml三个浓度进行筛选。

通过预实验确定了*筛选浓度后，就可以做稳定转染了。

a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1:4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50%~70%汇合时；

b 加G418：去掉培养液，PBS洗一次，加入按*筛选浓度配制好的G418筛选培养基。

c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。当有大量细胞死亡时，可以把G418浓度减半维持筛选。 筛选10~14天后，可见有抗性的克隆出现，停药培养，待其逐渐增大后；

d 挑单克隆：制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul。在96孔板中加入培养基150ul/孔，再加入细胞悬液10ul/孔。待其逐渐增大后转入到48孔中增殖。

e 单克隆鉴定：细胞大量扩增后，提取总RNA,做RT-PCR检测目的基因是否存在。