组织细胞

RNA提取试剂dNTP 混合物Taq DNA聚合酶*链cDNA合成试剂盒

离心管离心机水浴锅PCR管电泳仪凝胶图像分析系统移液管移液枪离心管盒

一、总RNA的提取 

见“总RNA的提取”相关内容。
 

二、cDNA*链的合成 

目前试剂公司有多种cDNA*链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
 

1． 在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg，补充适量的DEPC H₂O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，轻轻混匀、离心；
 

2．70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min；
 

3． 取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：*链cDNA   2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5 min；

4．加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42℃水浴中孵育50 min；
 

5． 于70℃加热15 min以终止反应；
 

6．将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
 

三、PCR 

1．取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：*链cDNA   2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
 

2．加入适量的ddH₂O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；
 

3．设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
 

4．电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
 

5．密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
 

1．在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；
 

2． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；
 

3．内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；
 

4． PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；
 

5． 防止DNA的污染： 采用DNA酶处理RNA； 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

1．反转录酶的选择
 

（1） Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。zui适作用温度为37℃；
 

（2）禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。zui适作用温度为42℃；
 

（3）Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn²⁺存在下，允许高温反转录RNA，以