微生物学技术：酵母细胞破碎实验

酵母菌

玻璃珠破菌缓冲液

玻璃珠拍打器

1.  培养并收集酵母菌细胞，在酵母消解酶缓冲液重悬菌体沉淀之前，测定压紧细胞的体积，以下所有步骤均在4℃进行。

2.  用1体积的玻璃珠破菌缓冲液重悬细胞。

3.  用2体积的玻璃珠破菌缓沖液与细胞混合，加4体积冰冷的酸洗玻璃珠。

4a.  当压紧的细胞休积＜10 ml，将细胞悬液转移至合适大小的带螺口的离心管中（悬液占离心管≤60%~70%的容积），于4℃以zui大速度下振荡30~60 s，将管置于冰上放置1~2 min，重复3~5次，在显微镜下检査破细胞的程度，继续步骤5。

4b.  当压紧的细胞体积＞10 ml，将细胞悬液转移到合适大小的玻璃珠搅拌容器中（建议用导热性能好的不锈钢材料）并加玻璃珠破菌缓冲液至容器的边缘，但加到容器中的缓冲液不超过1个细胞悬液的体积。装好搅拌杆和螺盖，确保将容器中所有空气排尽（排除空气以防止起泡和蛋白质变性这一点非常重要），高速搅拌60 s，冰上放置1~2 min，重复3~5次。

5.  沉淀玻璃珠，轻轻倒出上清，加入2~4体积的玻璃珠破菌缓冲液，颠倒管5~10次，待玻璃珠沉淀后轻轻倒出上清，合并上清液。

6.  合并的上清液于4℃，12 000 g 离心60 min，收集上清即为抽提液。长期贮存时，将其分成小份于液氮中快速冷冻，-80℃贮存。