士锋生物APAAP免疫组化实验操作过程

    (一) 基本原理
APAAP(Alkaline phosphatase-anti-alkaline phosphatase technique) 技术的基本原理为: 抗鼠IgG抗体作为桥梁，将鼠源性识别细胞抗原的*抗体与鼠源性的抗碱性磷酸酶单克隆抗体-碱性磷酸酶复合物相连接，使之成为Ag，-Ab１－Ab２-anti AP-AP的复合物。还可通过二抗将APAAP 复合物重复叠加起来，从而使多个碱性磷酸酶标记于组织细胞上*抗体所识别的抗原部位，提高了敏感性。

(二) 方法
分离外周血单个核细胞(PBMC)，洗涤后用含10％FCS犚PMI1640
调整细胞浓度约5×10６／ml
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自制制片机上制片，充分干燥
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用含丙酮-福尔马林固定液中固定30秒钟
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自来水、蒸馏水依次冲洗
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用TBS稀释特异性McAb或阴性对照抗体(1∶50～500)，
每片加30～50μl
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室温湿盒孵育30min，或4℃冰箱湿盒中
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充分用TBS冲洗后，加1∶50羊(兔)抗鼠IgG
(GAM或RAM IgG)30～50μl
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室温湿盒孵育30min
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TBS冲洗后加碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(1∶2000)复合物(APAAP)
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TBS冲洗后可重复叠加GAM或RAM IgG和APAAP2次，每次孵育10min
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冲洗后底物液显色10～15min
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自来水冲洗，苏木精衬染，光镜下观察
(三) 试剂器材
载玻片，制片机，湿盒，光学显微镜
1. APAAP配制：牛肠碱性磷酸酶Ⅶ型(Sigma)4.3μl或粗酶2mg溶于1ml 0.05M,PH7.6的TBS，加抗碱性磷酶单克隆抗体腹水2μl制成，临用时作1∶2～1∶4稀释。
2. AP底物配制：Naphathol(萘酚)AS-MX(Sigma) 25mg溶于1ml二甲基甲酰胺，加PH8.2, 0.1M Tris-HCl缓冲液49ml，再加Fast Red ITR (Sigma) 50mg，充分混匀，用前配制。必要时加12mg Levamisole以抑制内源性碱性磷酸酶。亦可按上述比例少量配制。
3. 丙酮-福尔马林固定液：4℃保存
100mg Na２HPO４
500mg KH２PO４
150ml H２O
225ml Acetone
125ml Formalin